目的:人類(lèi)免疫缺陷病毒1型（HIV-1）,作為獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）（又稱(chēng)艾滋�。┑闹饕≡w亞型,具有較高的傳染性及較強(qiáng)的致病性。實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的HIV-1感染檢測(cè)在AIDS的診斷、治療、防控中起著至關(guān)重要的作用。目前,針對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的特異性免疫抗體的血清學(xué)檢測(cè)是HIV-1感染實(shí)驗(yàn)室診斷的主要手段。然而抗體產(chǎn)生前的“窗口期”阻礙了對(duì)感染結(jié)果的早期判斷。另外,針對(duì)HIV-1核酸的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè),雖然不存在“窗口期”的漏檢,但是其對(duì)人員、設(shè)備要求高。為了更好地滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)HIV-1檢測(cè)方法的需求,本研究提出了一個(gè)簡(jiǎn)單、靈敏的全核酸級(jí)聯(lián)反饋放大策略,對(duì)HIV-1相關(guān)DNA（HIV-1 DNA）進(jìn)行了無(wú)蛋白酶參與的均相檢測(cè),以期為早期HIV-1感染提供新的檢測(cè)思路。方法:1.反應(yīng)過(guò)程:當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí),通過(guò)目標(biāo)驅(qū)動(dòng)的催化發(fā)夾組裝（CHA）循環(huán)反應(yīng),依次打開(kāi)發(fā)夾H₁和H₂,形成雙末端具有活性DNAzyme的H₁-H₂雜交雙鏈。其進(jìn)一步循環(huán)剪切含rA切割位點(diǎn)的熒光淬滅發(fā)夾底物H

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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催化發(fā)夾組裝的雙端DNAzyme級(jí)聯(lián)反饋放大用于HIV-1DNA分析的原理圖

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文16然后將10μL混合溶液上樣至12%非變性聚丙烯酰胺凝膠中。在室溫下，上樣后的凝膠在1×TBE緩沖液（89mMTris-boricacid，2mMEDTA，pH=8.4）中以100V恒定電壓運(yùn)行50分鐘。隨后，凝膠在GelRed染液中染色30分鐘。最后，用Bio-RadChemDocXRS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行顯像。2結(jié)果與討論2.1發(fā)夾探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)所有核酸發(fā)夾（H1，H2和H3）在設(shè)計(jì)時(shí)都通過(guò)了開(kāi)放在線軟件NUPACK（http://www.nupack.org/）的驗(yàn)證，具體的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖2所示。由于發(fā)夾中特定結(jié)構(gòu)域決定了該域中核苷酸的類(lèi)型，所以長(zhǎng)度為2或3個(gè)核苷酸的小莖不可避免地出現(xiàn)在發(fā)夾結(jié)構(gòu)中。研究報(bào)道[46]，探針發(fā)夾環(huán)內(nèi)2-3個(gè)核苷酸長(zhǎng)的小莖不會(huì)對(duì)分子信標(biāo)的性能產(chǎn)生不利影響，表明發(fā)夾探針中的小莖不會(huì)影響主發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這可能是由于2或3個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的小莖具有較小的負(fù)自由能，其無(wú)法在室溫下穩(wěn)定存在。因此，本研究使用這些發(fā)夾來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖2發(fā)夾探針的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig.2Secondarystructurediagramsofhairpinprobes2.2可行性分析為了驗(yàn)證該級(jí)聯(lián)反饋放大方法檢測(cè)HIV-1DNA的可行性，首先記錄了不同混合條件下的熒光發(fā)射光譜。如圖3（A）所示，當(dāng)僅有H1或H2被排除在反應(yīng)系統(tǒng)

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文17之外時(shí)，只能獲得非常弱的背景熒光信號(hào)（曲線a和b）。這一結(jié)果表明，在目標(biāo)觸發(fā)的CHA過(guò)程不能完整進(jìn)行時(shí)，H1和H2末端的兩個(gè)空間分裂的依賴(lài)Mg2+的DNAzyme序列不具有催化活性，其不能剪切分離H3以恢復(fù)熒光信號(hào)。此外，沒(méi)有目標(biāo)DNA參與的反應(yīng)系統(tǒng)顯示出比上述情況稍高但仍較弱的背景熒光強(qiáng)度（曲線c），這表明可能由于發(fā)夾莖區(qū)末端雙螺旋結(jié)構(gòu)的“呼吸”作用而自發(fā)生成極少量H1-H2復(fù)合物參與后續(xù)反應(yīng)[47]。但是，當(dāng)添加目標(biāo)DNA到反應(yīng)系統(tǒng)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熒光強(qiáng)度急劇增加（曲線e），表明CHA-DNAzyme級(jí)聯(lián)反饋放大過(guò)程已被成功觸發(fā)。另外，在不存在Mg2+的情況下，觀察到強(qiáng)度較低的熒光信號(hào)（曲線d），證明了沒(méi)有Mg2+作為輔因子，DNAzyme沒(méi)有催化活性。此外，也暗示了Mg2+的存在能穩(wěn)固H3的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，降低其背景熒光強(qiáng)度。為了進(jìn)一步證實(shí)雙端DNAzyme雙鏈的形成和依賴(lài)Mg2+的DNAzyme剪切作用，隨后進(jìn)行了Native-PAGE。從圖3（B）中可以看出，H1和H2混合后幾乎沒(méi)有出現(xiàn)新的明顯條帶（泳道3），表明H1和H2在沒(méi)有目標(biāo)DNA的情況下能相對(duì)穩(wěn)定共存。當(dāng)目標(biāo)DNA與H1和H2一起孵育時(shí)，在H1上方產(chǎn)生了一條明亮的新條帶，其電泳遷移率慢得多(泳道5)，表明通過(guò)CHA反應(yīng)，成功地形成了相應(yīng)的H1-H2雙鏈。此外，與泳道6中的H3條帶相比，泳道8中的H3條帶顏色變淡，同時(shí)在其下方出現(xiàn)了電泳遷移率更快的新條帶，這表明H1-H2雙鏈上的雙端DNAzyme能有效地剪切H3。在沒(méi)有目標(biāo)DNA參與的情況下，泳道7上沒(méi)有出現(xiàn)上述明顯現(xiàn)象。這些結(jié)果均證明了所提出的級(jí)聯(lián)反饋放大方法能夠用于檢測(cè)HIV-1DNA。圖3（A）不同混合物的熒光發(fā)射光譜;（B）CHA-DNAzyme級(jí)聯(lián)反饋放大過(guò)程的Native-PAGE表征


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