發(fā)布時(shí)間：2021-01-15 05:45

　　目的:HPV反復(fù)或持續(xù)感染是宮頸癌變發(fā)生主要但并非唯一的病理因素,尋找其他致癌因子或協(xié)同HPV的致癌因素成為目前關(guān)注的焦點(diǎn)。核不均一核糖核蛋白E2（hnRNP E2）是存在于細(xì)胞核中的一種RNA結(jié)合蛋白,其含有的獨(dú)特KH域具有DNA和RNA的結(jié)合位點(diǎn),為其實(shí)現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、控制mRNA的穩(wěn)定和翻譯等一系列生物學(xué)功能提供了前提條件。研究表明,hnRNP E2在眾多腫瘤中存在異常高表達(dá),但在宮頸癌變中的表達(dá)情況尚無(wú)定論。hnRNP E2可以與DNA發(fā)生結(jié)合,但其在HPV16陽(yáng)性的Siha細(xì)胞中與全基因組DNA的結(jié)合尚不明確。此次研究選取不同宮頸病變患者,檢測(cè)hnRNP E2蛋白表達(dá)水平,同時(shí)檢測(cè)HPV16感染情況,探討hnRNP E2與HPV16在宮頸癌變中的作用及其相互關(guān)系;進(jìn)一步在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,選擇HPV16陽(yáng)性的Siha細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)媒介,應(yīng)用ChIP-Seq技術(shù),分析hnRNP E2與全基因組的結(jié)合位點(diǎn)以及結(jié)合的基因,全面地揭示hnRNP E2結(jié)合位點(diǎn)和基因的分布特征,以及對(duì)hnRNP E2結(jié)合基因進(jìn)行GO功能分類,對(duì)靶基因可能參與的生物信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè),從而為宮頸癌病... 

【文章來(lái)源】： 高雯 山西醫(yī)科大學(xué)

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

研究對(duì)象篩選流程圖

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文12圖1-2染色質(zhì)酶切情況5）測(cè)純化后的DNA濃度，其在50-200μg/mL之間可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。（4）染色質(zhì)免疫沉淀：1）1個(gè)IP反應(yīng)需含有7-8μgDNA的交聯(lián)染色質(zhì)片段，根據(jù)DNA濃度，計(jì)算其體積，每個(gè)樣品管中均取10μL出來(lái)作為2%輸入對(duì)照（2%Input），-20°C保存至第（5）的1）中使用。2）向每個(gè)實(shí)驗(yàn)管中加1.5μgAnti-hnRNPE2抗體；陰性對(duì)照管加2μL正常兔IgG;陽(yáng)性對(duì)照管加10μL組蛋白H3RabbitmAb，4℃孵育過(guò)夜。3）取30ul蛋白G磁珠加入到每個(gè)管中，4°C搖床孵育2小時(shí)。4）將離心管放在磁性分離架上，蛋白G磁珠吸附至管壁，溶液澄清后，吸走上清。5）加入1ml低鹽漂洗液，取下樣品管，4°C搖床孵育5分鐘，重復(fù)4）和5）兩次。（3mL低鹽漂洗液：300μL10×ChIPBuffer+2.7mL超純水）6）加入1ml高鹽漂洗液，取下樣品管，4°C搖床孵育5分鐘，重新至于磁性分離架上，溶液澄清后，吸走上清。（1mL高鹽漂洗液：100μL10×ChIPBuffer+900μL超純水+70μL5MNaCl）（5）將染色體從抗體/蛋白G微珠上洗脫并解交聯(lián)：1）在所有樣品管和2%Input管中均加入150ul1×ChIP洗脫緩沖液（75ul2×ChIP洗脫緩沖液+75ul水），其中2%Input管室溫放置，隨后使用。2）65°C孵育40分鐘。3）將離心管放在磁性分離架上，靜置，溶液澄清后，將上清（染色質(zhì)）轉(zhuǎn)移到新的離心管中。4）在所有管中，包括第一步的2%Input管，加入6ul5MNaCl和2ul蛋白酶K，65°C孵育2.5-3h。（6）用離心柱通過(guò)結(jié)合、漂洗和洗脫過(guò)程純化DNA。

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文13（7）用PCR定量進(jìn)行ChIP富集效率的分析PCR擴(kuò)增包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、Input對(duì)照以及空白對(duì)照。每個(gè)PCR管中加入18μL反應(yīng)體系和2μL各自對(duì)應(yīng)的DNA樣品作為模板，PCR反應(yīng)體系配制（表1-1）和反應(yīng)程序（表1-2）如下所示：表1-1PCR反應(yīng)體系試劑體積無(wú)核酸酶的水12.5ul10×PCR緩沖液2.0ul4mMdNTP混合物1.0ul5μMRPL30引物2.0ulTaqDNA聚合酶0.5ul總共18ul表1-2PCR反應(yīng)程序過(guò)程溫度時(shí)間a預(yù)變性95℃5minb變性95℃30sc退火62℃30sd延伸72℃30se重復(fù)b-d，共34個(gè)循環(huán)f終末延伸72℃5min從每個(gè)反應(yīng)管中取10ul進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。Input對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照于161bp處獲得RPL30基因條帶，如圖1-3所示。以上結(jié)果說(shuō)明ChIP實(shí)驗(yàn)是有效的。圖1-3陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及Input對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)三個(gè)重復(fù)hnRNPE2ChIP樣品及Input對(duì)照的濃度及純度，見表1-1。ChIP-Seq的送樣要求為：濃度≥1ng/μL；純度為1.8-2.2；總DNA量≥20ng，本次的指標(biāo)均滿足。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]hnRNP E2對(duì)HPV16關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)及其在宮頸病變中的作用[D]. 宋志超.山西醫(yī)科大學(xué) 2018
[2]hnRNP E1與HPV16早期基因E2和E6在宮頸病變中的作用及交互效應(yīng)[D]. 李巧玲.山西醫(yī)科大學(xué) 2017



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