目的（1）對(duì)新生大鼠心肌細(xì)胞（neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs）的分離培養(yǎng)方法進(jìn)行優(yōu)化,尋找一種較為高效的新生大鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)方法;（2）研究CTRP3在心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI）中的作用。方法（1）新生大鼠心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)。無菌操作快速取得大鼠乳鼠心臟后以機(jī)械處理將心臟剪為心肌組織塊;采用兩種消化方法分別對(duì)心肌組織進(jìn)行消化:（1）雙酶消化法:0.08%胰酶和0.125%膠原酶混合（1:1）消化心肌組織,（2）0.08%胰酶+機(jī)械消化法:先用0.08%胰酶消化心肌組織后再以機(jī)械消化法消化剩余的心肌組織;用100μm的細(xì)胞篩過濾得到的細(xì)胞混懸液,然后進(jìn)行差速貼壁培養(yǎng);通過臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測差速貼壁分離后的細(xì)胞數(shù)量及存活率,在光學(xué)倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及特征,用共聚焦免疫熒光染色法鑒定新生大鼠心肌細(xì)胞的純度。（2）缺氧/復(fù)氧損傷模型構(gòu)建:應(yīng)用氮?dú)獗苎醴ǎㄈ龤馀囵B(yǎng)箱）建立NRCMs缺氧/復(fù)氧損傷模型。（3）應(yīng)用MTT法檢測NRCMs對(duì)藥物（CTRP3）的反應(yīng)性。（4... 

【文章來源】：延安大學(xué)陜西省

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

心肌細(xì)胞的分離A)迅速取出7只新生大鼠的心臟并在預(yù)冷的PBS緩沖液中清洗

-9-分別收集兩組差速貼壁培養(yǎng)后的細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，死細(xì)胞被染為藍(lán)色，活細(xì)胞拒染呈透明色。根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)，7只乳鼠分離的心肌組織分別用兩種方法消化后得到的細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞存活率如圖2所示，雙酶消化法獲得的細(xì)胞數(shù)量約為（0.9±0.6）×106個(gè)，細(xì)胞存活率為（56.6±32.4）%；0.08%胰酶+機(jī)械消化法的細(xì)胞數(shù)量約為（2.2±1.7）×106個(gè)，細(xì)胞存活率為（93.2±53.6）%。0.08%胰酶+機(jī)械消化組細(xì)胞數(shù)量及存活率均高于雙酶消化組（P＜0.05）。圖2不同消化方法對(duì)細(xì)胞數(shù)量及存活率影響A:細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果（×10），�。�0.08%胰酶+機(jī)械消化法，ⅱ：雙酶消化法；B:細(xì)胞數(shù)量；C:細(xì)胞存活率；*p＜0.05（n=3）3.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)及自發(fā)性搏動(dòng)的觀察兩組細(xì)胞剛接種未貼壁時(shí)呈圓形，折光性強(qiáng)。培養(yǎng)12h后NRCMs開始貼壁生長。培養(yǎng)24h后，可觀察到部分NRCMs貼壁，伸出偽足，呈菱形、梭形或不規(guī)則狀，并出現(xiàn)自發(fā)性搏動(dòng)。培養(yǎng)48h后，NRCMs基本都已貼壁，細(xì)胞成簇生長，細(xì)胞AⅱBCⅰ

-10-簇之間出現(xiàn)更廣范圍的連接。細(xì)胞簇之間開始出現(xiàn)同步搏動(dòng)且搏動(dòng)有力，博動(dòng)頻率在50-120次/分鐘。培養(yǎng)96h后，顯微鏡下可觀察到視野中的細(xì)胞成片狀同步搏動(dòng)，收縮有力。培養(yǎng)12天后，NRCMs開始老化，搏動(dòng)幅度較前減弱、頻率減慢（20-60次/分鐘）并伸出更多更長的偽足。差速貼壁分離后，原來的細(xì)胞培養(yǎng)皿里的原代成纖維細(xì)胞如果需要可繼續(xù)用于培養(yǎng)及傳代。圖3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察A）未貼壁的NRCMs（0.08%胰酶+機(jī)械消化法，×10）；B）培養(yǎng)24h的NRCMs（0.08%胰酶＋機(jī)械消化法，×10）；C）培養(yǎng)48h的NRCMs（0.08%胰酶＋機(jī)械消化法，×40）；D）培養(yǎng)48h的NRCMs（雙酶消化法，×40）；E）培養(yǎng)12d后NRCMs較前伸出更多更長的偽足（0.08%胰酶＋機(jī)械消化法，×40）；F）培養(yǎng)24h的原代心臟成纖維細(xì)胞（0.08%胰酶+機(jī)械消化法，×40）。3.3NRCMs活力的觀察光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)NRCMs的搏動(dòng)數(shù)量，顯微鏡下觀察到雙酶消化法組NRCMs搏動(dòng)率為（62.6±33.6）%，0.08%胰酶+機(jī)械消化法組NRCMs搏動(dòng)率為（92.4±32.4）%。0.08%胰酶+機(jī)械消化得到的NRCMs搏動(dòng)細(xì)胞數(shù)量百分比高于雙酶消化組（圖4，P＜0.05）。DEBCFA

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2005～2017年中國疾病負(fù)擔(dān)研究報(bào)告[J]. 殷鵬,齊金蕾,劉韞寧,劉江美,李婕,曾新穎,王黎君,周脈耕.  中國循環(huán)雜志. 2019(12)
[2]乳鼠心肌細(xì)胞可成片生長的分離和培養(yǎng)方法[J]. 黃紹代,陳鵬,吳超,胡丹,彭江,田建偉.  中國組織工程研究. 2017(24)



本文編號(hào)：2972949