研究目的本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)5名健康志愿者接種季節(jié)性流感疫苗前后外周血中記憶B細(xì)胞重鏈BCR CDR3序列進(jìn)行組庫(kù)特征分析,從免疫組庫(kù)的角度探討流感疫苗的免疫效應(yīng),為疫苗的免疫效應(yīng)研究和新疫苗的研發(fā)提供新的理論依據(jù)和研究思路。研究方法1.本研究共招募志愿者5名,均通過肌肉注射季節(jié)性流感疫苗,分別于注射疫苗前和注射疫苗后第28天采集外周血50ml,分離血清,采用間接ELISA法檢測(cè)志愿者外周血中流感病毒特異性抗體的變化情況;2.于注射疫苗前和注射疫苗后第28天采集外周血50ml,磁珠分選出總B細(xì)胞,體外經(jīng)滅活H7N9病毒刺激6天,Elispot法檢測(cè)接種疫苗前后志愿者外周血中H3記憶B細(xì)胞頻率的變化;3.免疫磁珠分離疫苗注射前和疫苗注射后28天外周血記憶B細(xì)胞,提取RNA,送華大基因公司進(jìn)行BCR H-CDR3測(cè)序,利用IMGT/High V-QUEST分析軟件,將測(cè)序得到的序列進(jìn)行比對(duì)分析,分析內(nèi)容如下:（1）CDR3序列的多樣性以及克隆分布與豐度;（2）IGHV、IGHJ、IGHD基因家族取用和配對(duì)分布,以觀察基因片段取用的偏好性;（3）各樣本間CDR3重疊率;（4）CDR3與... 

【文章來源】：遵義醫(yī)科大學(xué)貴州省

【文章頁(yè)數(shù)】：89 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

信息分析流程圖

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文何江211.4.11測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)出與過濾使用Hiseq4000平臺(tái)對(duì)10個(gè)樣本進(jìn)行免疫組庫(kù)測(cè)序，利用過濾軟件SOAPnuke對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，包括去除接頭污染（切除接頭序列或去除包含接頭的reads），去除未知堿基N含量大于10%的reads，去除低質(zhì)量的reads（我們定義質(zhì)量低于15的堿基占該reads總堿基數(shù)的比例大于50%的reads為低質(zhì)量的reads）；將過濾后的cleanreads保存為FASTQ格式；圖2MiXCR比對(duì)示意圖Fig.2SchematicdiagramofMiXCRcomparion1.4.12序列比對(duì)使用MiXCR作為BCR比對(duì)的軟件，使用參數(shù)如下：（1）mixcraligninput_R1.fastqinput_R2.fastqalignments.vdjca；（2）mixcrassemblealignments.vdjcaclones.clns；

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文何江22（3）mixcrexportClones--chainsIGHclones.clnsclones.txt1.4.13免疫組庫(kù)后續(xù)分析數(shù)據(jù)比對(duì)后的結(jié)果中包含了樣本中所有clone類型頻率、序列等信息，但還需要對(duì)這一部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析反映克隆群體結(jié)構(gòu)，以及做樣本間及組間比較。我們應(yīng)用VDJtools作為比對(duì)后分析的軟件，后續(xù)分析包括基本統(tǒng)計(jì)分析、克隆多樣性評(píng)估、樣本間克隆重疊、樣本間克隆群體相似度分析以及層次聚類分析等。圖3VDJtools示意圖Fig.3TheusageofVDJtools1.4.14數(shù)據(jù)分析及作圖采用Excel、IMGT/HighV-QUEST、Graphpad、Sigmaplot等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖。采用IBMSPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分析則采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，配對(duì)t檢驗(yàn)，否則采用四分位數(shù)表示，Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。圖表中ns表示差異不顯著（P>0.05）；*表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；**表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）；***表示有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001）。


本文編號(hào)：2961917