目的:近期研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）對治療帕金森病的相關(guān)研究取得了一些成果,但是其作用機(jī)制未能完全明確。我們通過α-突觸核蛋白處理人小膠質(zhì)細(xì)胞系（HMC-3）與神經(jīng)元細(xì)胞系（SH-SY5Y）體外混合培養(yǎng),模擬帕金森患者黒質(zhì)紋狀體中神經(jīng)元細(xì)胞所處的免疫環(huán)境;利用低氧預(yù)處理的嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞（OM-MSCs）與上述細(xì)胞共培養(yǎng),觀察HMC-3表型的變化、檢測α-突觸核蛋白含量、相應(yīng)免疫因子的變化以及SH-SY5Y的凋亡情況,從而探討低氧預(yù)處理OM-MSCs對α-突觸核蛋白的自噬清除機(jī)制以及對神經(jīng)元保護(hù)作用。方法:（1）人OM-MSCs獲取、培養(yǎng);利用流式細(xì)胞學(xué)以及免疫熒光對OMMSCs進(jìn)行鑒定;（2）利用α-突觸核蛋白預(yù)處理HMC-3,使其極化;利用低氧裝置對低氧組的OM-MSCs進(jìn)行低氧預(yù)處理。（3）利用Transwell小室將HMC-3、SH-SY5Y與OM-MSCs進(jìn)行體外共培養(yǎng);（4）共培養(yǎng)后觀察各組HMC-3的形態(tài);Western Blot及免疫熒光檢測各組HMC-3的α-突觸核蛋白、IL-1β、CD206、溶酶體等相關(guān)標(biāo)記物的含量;透射電子顯微鏡觀察各組HMC-3自噬溶酶... 

【文章來源】：湖南師范大學(xué)湖南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

Transwell裝置分組示意圖

碩士學(xué)位論文14第3章結(jié)果3.1OM-MSCs的鑒定3.1.1細(xì)胞計(jì)數(shù)及免疫熒光鑒定在OM-MSCs培養(yǎng)至第四代時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞呈旋渦狀生長方式，單個(gè)細(xì)胞顯示出成纖維細(xì)胞形態(tài)（圖3-1A）。自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀顯示，一瓶T25培養(yǎng)瓶的細(xì)胞數(shù)量約為1~2×106，細(xì)胞活率在95%以上（圖3-1B）�？紤]到細(xì)胞經(jīng)過消化、離心等操作的處理，以及細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的局限性，細(xì)胞的真實(shí)活率會(huì)更高。進(jìn)一步根據(jù)OM-MSCs表達(dá)的標(biāo)記物進(jìn)行免疫熒光染色鑒定，OM-MSCs的Nestin、STRO-1均為陽性（圖3-1C、D），表明獲取的OM-MSCs是一種間充質(zhì)干細(xì)胞。圖3-1：第四代OM-MSCs光鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞免疫熒光鑒定A:OM-MSCs光鏡下×100；B：細(xì)胞計(jì)數(shù)圖像；B：細(xì)胞計(jì)數(shù)圖像；C：Nestin熒光染色×400；D：STRO-1熒光染色；×4003.1.2流式細(xì)胞學(xué)鑒定將第四代的OM-MSCs進(jìn)行流式學(xué)檢測，結(jié)果顯示：OM-MSCs表達(dá)CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD146，且各陽性標(biāo)記物純度均在96%以上（圖3-2）。OM-MSCs不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34、CD45，但表達(dá)MSCs的其他標(biāo)記物，再次表明OM-MSCs是一種間充質(zhì)干細(xì)胞。

低氧預(yù)處理OM-MSCs促進(jìn)HMC-3對α-突觸核蛋白自噬清除的研究15圖3-2：第四代OM-MSCs各表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞學(xué)檢測3.2HMC-3的形態(tài)我們用小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba1抗體標(biāo)記HMC-3胞漿觀察細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞熒光顯微鏡下觀察到，對照組的HMC-3核周胞漿緊密，而α-突觸核蛋白處理的HMC-3呈現(xiàn)出細(xì)長的絲狀偽足（圖3-3），類似M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的極化；相反與OM-MSC的共培養(yǎng)后，HMC-3出現(xiàn)更少的偽足，趨向于M2型的小膠質(zhì)細(xì)胞。圖3-3：各組HMC-3的Iba1免疫熒光顯示細(xì)胞形態(tài)×400

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]低氧微環(huán)境促進(jìn)人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及其機(jī)制[J]. 卓毅,李璇,段答,葛麗特,袁挺,吳沛,王昊,龍浪,盧明.  中國組織工程研究. 2017(33)
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[3]脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在神經(jīng)修復(fù)中的研究進(jìn)展[J]. 葛麗特,盧明.  中國微侵襲神經(jīng)外科雜志. 2014(12)
[4]嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞在神經(jīng)修復(fù)中的研究進(jìn)展[J]. 葛麗特,盧明.  國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志. 2014(01)

碩士論文
[1]人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞與嗅鞘細(xì)胞在鼻黏膜中分布的研究[D]. 黃佩琦.湖南師范大學(xué) 2018



本文編號(hào)：2953513