本文關(guān)鍵詞：丹參不同提取部位保護(hù)高糖損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞的活性及質(zhì)量控制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本論文通過對(duì)丹參不同提取部保護(hù)高濃度葡萄糖損傷的內(nèi)皮祖細(xì)胞的活性部位進(jìn)行篩選,并探討活性部位的保護(hù)作用與NO/e NOS信號(hào)通路間的關(guān)系,同時(shí)對(duì)活性組分進(jìn)行了質(zhì)量控制研究,以期為以后丹參制藥工藝的改進(jìn)以及臨床療效的提高提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:取丹參藥材粗粉,用6倍量90%的乙醇進(jìn)行回流提取,得到丹參的乙醇總提取液,再濃縮至1.5g生藥/ml,再分別用pet、CHCl3、CH2COOCH2CH3、Bu OH及H2O進(jìn)行萃取。最后,將藥物殘?jiān)?倍量的水煎煮。減壓回收各萃取部位的溶劑,真空干燥,得pet、CHCl3、CH2COOCH2CH3、Bu OH、H2O部位及藥渣水煎液部位。細(xì)胞模型的建立:將誘導(dǎo)培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)于含60 mmol·L-1葡萄糖溶液的M199培養(yǎng)液中,建立模型細(xì)胞。將體外培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞分為正常組、高濃度葡萄糖損傷組、滲透壓對(duì)照組以及各部位丹參提取物組,其中正常組細(xì)胞:培養(yǎng)液含有5.5 mmol·L-1的葡萄糖(D-glucose);模型組細(xì)胞:培養(yǎng)液含有60 mmol·L-1的葡萄糖(D-glucose);滲透壓對(duì)照組:培養(yǎng)液中含有5.5 mmol·L-1的葡萄糖(D-glucose)和55.5 mmol·L-1的甘露醇(D-mannitol)。利用MTT法篩選出受試藥物對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖能力的影響,以確定最佳受試藥物活性部位及其作用濃度。采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法對(duì)各組內(nèi)皮祖細(xì)胞中的NO、e NOS的含量進(jìn)行檢測(cè);采用免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)e NOS和p-e NOS的分布情況。對(duì)保護(hù)高濃度葡萄糖損傷的內(nèi)皮祖細(xì)胞活性最佳部位中的有效成分進(jìn)行薄層色譜鑒別、并且利用高效液相(HPLC)對(duì)SM3及SM6部位進(jìn)行定量鑒別并建立SM3及SM6的指紋圖譜。結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,乙酸乙酯部位(SM3)對(duì)高濃度葡萄糖損傷的內(nèi)皮祖細(xì)胞的在所有6各組分中保護(hù)作用最佳。此外,藥渣水煎液部位(SM6)亦表現(xiàn)出較好的活性作用,且這兩個(gè)活性兩部位的最低有效濃度均是10μg·m L-1。ELISA試劑盒測(cè)試結(jié)果表明,相比于高濃度葡萄糖處理后的內(nèi)皮祖細(xì)胞中NO以及e NOS的含量顯著降低(p均0.05),經(jīng)丹參活性組分(SM3和SM6)處理后,細(xì)胞中NO以及e NOS的含量相比于高糖處理組得到了顯著地升高(p均0.05)。免疫熒光結(jié)果表明:e NOS蛋白在各組細(xì)胞中的分布情況大致相同,主要是集中分布在細(xì)胞膜上以及細(xì)胞質(zhì)中,各組相比并無顯著差異。p-e NOS蛋白在各組細(xì)胞中的分布情況有所差異,正常組中p-e NOS蛋白的表達(dá)既出現(xiàn)在細(xì)胞膜上,同時(shí)也出現(xiàn)在細(xì)胞核中,經(jīng)高糖損傷后,包括高糖損傷模型組以及SM3和SM6組分處理組,p-e NOS主要分布在細(xì)胞核中。對(duì)SM3及SM6進(jìn)行了薄層色譜鑒別,并分別對(duì)10批SM3和SM6部位進(jìn)行了定量分析,同時(shí)分別建立了指紋圖譜,結(jié)果表明SM3和SM6部位中均檢測(cè)到丹參素鈉和丹酚酸B兩種有效物質(zhì),并得出丹參素鈉在10批丹參乙酸乙酯部位(SM3)中的平均含量(每1 mg提取物中所含的質(zhì)量)為9.283μg·mg-1;在藥渣水煎液(SM6)中的平均含量(每1 mg提取物中所含的質(zhì)量)為10.849μg·mg-1;丹酚酸B在乙酸乙酯部位(SM3)的平均含量(每1 mg提取物中所含的質(zhì)量)為27.344μg·mg-1;在藥渣水煎液部位的平均含量(每1 mg提取物中所含的質(zhì)量)為9.674μg·mg-1。10批乙酸乙酯部位(SM3)通過色譜圖的比對(duì)確定了28個(gè)共有峰。對(duì)10批乙酸乙酯部位(SM3)的相似度進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果表明,與對(duì)照相比,S1-S10的相似度均大于0.940,其中S5-S10的相似度超過0.990,10批藥渣水煎液部位(SM6)對(duì)比色譜圖確定共有峰為20個(gè)。對(duì)10批藥渣水煎液部位(SM6)的相似度進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果顯示,與對(duì)照相比,S1-S10的相似度均大于0.950。結(jié)論:乙酸乙酯部位(SM3)對(duì)于高糖損傷的內(nèi)皮祖細(xì)胞的保護(hù)作用是最為顯著的,藥渣水煎液同樣具有良好的活性作用,SM3以及SM6發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能與活性部位可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中的NO/e NOS信號(hào)通路具有一定的關(guān)聯(lián)性。本論文還對(duì)SM3和SM6這兩個(gè)活性部位的提取方法進(jìn)行了質(zhì)量控制研究。說明SM3和SM6不僅具有生物學(xué)活性,同時(shí)其質(zhì)量可控穩(wěn)定,為今后制藥工藝的改進(jìn)、臨床療效的提高提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：丹參 內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC) 保護(hù)作用 NO/eNOS 質(zhì)量控制
【學(xué)位授予單位】：山東中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R284;R285
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 引言10-12
• 第一部分 綜述12-19
• 1 丹參化學(xué)成分的研究12-13
• 2 丹參提取方法的研究13-14
• 3 丹參指紋圖譜的研究14-15
• 4 丹參的藥理作用及相關(guān)作用機(jī)制15-18
• 5 小結(jié)18-19
• 第二部分 丹參不同部位提取物保護(hù)高糖損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞的活性研究19-35
• 1 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 2 實(shí)驗(yàn)方法21-26
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-33
• 4 結(jié)論與討論33-35
• 第三部分 丹參保護(hù)高糖損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞活性部位的質(zhì)量控制研究35-73
• 第一章 丹參保護(hù)高糖損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞活性部位的化學(xué)成分薄層鑒別35-38
• 1 儀器與試藥35-36
• 2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果36-37
• 3 小結(jié)與討論37-38
• 第二章 丹參保護(hù)高糖損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞活性部位中化學(xué)成分含量測(cè)定38-51
• 1 丹參素鈉的含量測(cè)定38-44
• 2 丹酚酸B的含量測(cè)定44-50
• 3 小結(jié)與討論50-51
• 第三章 丹參保護(hù)高糖損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞活性部位的高效液相指紋圖譜研究51-73
• 1 乙酸乙酯部位（SM3）指紋圖譜的建立51-63
• 2 藥渣水煎液部位（SM6）指紋圖譜的建立63-73
• 結(jié)語(yǔ)73-74
• 參考文獻(xiàn)74-80
• 致謝80-81
• 論文著作81-93
• 詳細(xì)摘要93-98

【相似文獻(xiàn)】

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1 李燕,高平進(jìn),朱鼎良;內(nèi)皮祖細(xì)胞研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2002年03期

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本文編號(hào)：292152