目的:探討NLR家族含CARD結(jié)構(gòu)蛋白3(NLR family CARD-containing 3,NLRC3)對肝缺血再灌注體外模型RAW264.7細胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)炎性反應(yīng)的影響,明確NLRC3減輕RAW264.7細胞H/R炎性反應(yīng)的具體分子機制。方法:建立小鼠肝臟缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型,采用Western blot技術(shù)檢測肝組織NLRC3蛋白表達以及ELISA技術(shù)檢測血清IL-1β水平;建立RAW264.7細胞H/R體外模型,Western blot法檢測RAW264.7細胞中NLRC3、TRAF6及其K63泛素化、NF-κB p65亞基、磷酸化p65(p-p65)、IκBα的蛋白水平;采用Co-IP技術(shù)檢測RAW264.7細胞內(nèi)NLRC3和TRAF6蛋白的生理性相互結(jié)合;運用細胞免疫熒光技術(shù)檢測RAW264.7細胞中NF-κB p65亞基入核水平;采用ELISA技術(shù)檢測細胞培養(yǎng)液中IL-1β的含量。結(jié)果:在小鼠肝臟I/R模型中,隨再灌注時間延長,血清IL-1β含量增高(P0.05),NLRC3蛋白在肝組織中的表達降低(P0.05);在RAW264.7細胞H/R體外模型中,NLRC3、IκBα蛋白表達隨復(fù)氧時間增加而降低,而p-p65/p65、TRAF6蛋白及其K63泛素化水平則與之相反(P0.05);Co-IP結(jié)果表明NLRC3與TRAF6之間存在生理性相互結(jié)合;過表達NLRC3對TRAF6蛋白的組成性表達無顯著影響(P0.05),但能明顯降低H/R細胞模型中TRAF6-K63泛素化、p-p65/p65蛋白水平,上調(diào)IκBα表達(P0.05);過表達NLRC3顯著抑制NF-κB p65亞基激活核轉(zhuǎn)運水平(P0.05),細胞培養(yǎng)液中IL-1β的含量也明顯降低(P0.05)。結(jié)論:在小鼠肝臟I/R和RAW264.7細胞H/R模型中,NLRC3的蛋白表達隨再灌注/復(fù)氧時間延長而降低。過表達NLRC3對H/R炎癥模型中促炎因子的釋放產(chǎn)生顯著抑制作用,其可能機制為通過降低TRAF6-K63泛素化水平抑制NF-κB信號通路活化從而減輕細胞炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R657.3
【部分圖文】：

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文21圖1小鼠肝臟I/R處理后不同再灌注時間點血清IL-1β和肝組織NLRC3的表達變化Fig1TheconcentrationofIL-1βinmiceserumandexpressionofNLRC3inmicelivertissuesatdifferentreperfusiontimepointafterliverI/RtreatmentA：小鼠肝I/R模型中血清IL-1β含量；B：肝組織NLRC3蛋白水平；C:半定量分析肝組織NLRC3的蛋白表達。aP＜0.05vs假手術(shù)組。A：IL-1βserumlevelinmiceafterI/Rstimuli;B:TheNLRC3proteinlevelinliversfrommicesubjectedtoshamtreatmentorischemiafor1hfollowedbyreperfusionfortheindicatedtime;C:Semi-quantitativeanalysisofNLRC3proteinlevelineachgroup.aP＜0.05vsSham.2.2H/R處理后，細胞內(nèi)NLRC3和NF-κB的表達改變結(jié)合本課題組前期實驗結(jié)果[20]，在該項研究中我們構(gòu)建了缺氧12h，復(fù)氧時間梯度為R0h、R1h、R2h、R3h、R6h、R9h的RAW264.7細胞H/R炎癥模型。Westernblot結(jié)果示，與R0h組相比，細胞內(nèi)NLRC3和IκBα蛋白表達隨復(fù)氧時間延長而下降，而p-p65/p65比值隨復(fù)氧時間延長而增高（aP＜0.05）。結(jié)果表明，在RAW264.7細胞H/R模型復(fù)氧早期，NF-κB信號活化水平增高的同時NLRC3蛋白表達呈降低趨勢（圖2）。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文22圖2H/R處理后，不同復(fù)氧時間點RAW264.7細胞中NLRC3與NF-κB的蛋白表達改變Fig2TheproteinexpressionlevelsofNLRC3andNF-κBsignalinginRAW264.7cellsafterH/RtreatmentofindicatedreoxygenationtimepointA:NLRC3、p-p65、p65、IκBα的蛋白表達;B-D:NLRC3、p-p65/p65、IκBα蛋白水平的半定量分析。aP＜0.05vsR0h組。A:TheproteinlevelsofNLRC3、p-p65、p65andIκBα;B-D:Semi-quantitativeanalysisofNLRC3、p-p65/p65、IκBαproteinlevelineachgrouprespectively.aP＜0.05vsR0h.2.3H/R處理后，細胞內(nèi)TRAF6及其K63泛素化水平的表達改變采用免疫沉淀聯(lián)合印跡技術(shù)檢測經(jīng)缺氧12h，復(fù)氧0h、1h、2h、3h、6h、9h后的各組細胞內(nèi)TRAF6蛋白及其K63泛素化水平。結(jié)果顯示，與R0h組相比較，隨復(fù)氧時間增加，除外R1h升高程度組間差異不顯著，其余各組TRAF6蛋白表達及其K63泛素化水平均顯著增高（aP＜0.05）。結(jié)合2.2實驗結(jié)果，我們初步分析在RAW264.7細胞H/R模型中，NLRC3和TRAF6的蛋白表達可能呈負向變化趨勢。在此，我們選擇缺氧12h繼而復(fù)氧9h作為后續(xù)實驗中細胞H/R模型的標(biāo)本獲取和檢測時間點（圖3）。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文23圖3H/R處理后，不同復(fù)氧時間點RAW264.7細胞中TRAF6及其K63泛素化水平的蛋白表達改變Fig3ImmunoblotanalysisoftheTRAF6anditsK63-linkedubiquitinationexpressioninRAW264.7cellsafterH/RtreatmentofindicatedreoxygenationtimepointA:RAW264.7細胞內(nèi)TRAF6及其K63泛素蛋白表達；B:TRAF6蛋白半定量結(jié)果；C:TRAF6-K63泛素蛋白半定量結(jié)果。aP＜0.05vsR0h組。A:IPcombiningimmunoblottinganalysesofTRAF6anditsK63ubiquitinproteinlevels;B:RelativeexpressionlevelofTRAF6;C:RelativeexpressionlevelofTRAF6-K63ubiquitinprotein.aP＜0.05vsR0h.2.4NLRC3與TRAF6的生理性相互結(jié)合采用Co-IP實驗技術(shù)對RAW264.7細胞處于生理穩(wěn)態(tài)時NLRC3與TRAF6分子的相互結(jié)合情況進行檢測。實驗結(jié)果表明，用TRAF6抗體沉淀的蛋白提取物上樣電泳，轉(zhuǎn)膜后孵育NLRC3抗體，曝光顯影能檢測到NLRC3蛋白，且用NLRC3抗體沉淀的蛋白提取物中也能檢測到TRAF6蛋白，同時，IgG陰性對照組均未檢測到TRAF6和NLRC3蛋白表達，Lysate陽性對照組中可檢測到二者的蛋白表達
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