目的:本文旨在通過(guò)細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)研究人牙囊干細(xì)胞(human dental follicle stem cells,hDFSCs)外泌體對(duì)hDFSCs增殖分化的作用,低強(qiáng)度脈沖超聲(Low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)作為誘導(dǎo)因素對(duì)外泌體特性的影響及可能的調(diào)控機(jī)制。方法:1.收集10-14歲患者多生埋伏牙的牙囊組織,組織塊聯(lián)合酶消化法提取hDFSCs原代細(xì)胞,使用倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài),茜素紅和油紅O染色鑒定其成骨和成脂分化能力,流式細(xì)胞術(shù)鑒定表面抗原。2.LIPUS輻照處理hDFSCs為實(shí)驗(yàn)組,未做LIPUS處理的hDFSCs為對(duì)照組。超速離心法提取兩種處理?xiàng)l件下hDFSCs分泌的外泌體(con-Exo和LIPUS-Exo);通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法鑒定外泌體表面標(biāo)記蛋白;透射電鏡觀(guān)察外泌體形態(tài)特征;納米顆粒跟蹤分析技術(shù)分析外泌體粒子濃度和直徑分布;PKH26對(duì)兩種外泌體進(jìn)行體外熒光標(biāo)記,與hDFSCs進(jìn)行共培養(yǎng),激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察外泌體能否被內(nèi)吞。3.功能學(xué)實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組:(1)control;(2)con-Exo;(3)LIPUS-Exo。CCK8試驗(yàn)檢測(cè)con-Exo和LIPUS-Exo對(duì)hDFSCs增殖活性的影響。成骨誘導(dǎo)7天后,分別對(duì)3個(gè)組的hDFSCs進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)染色,并檢測(cè)其堿性磷酸酶(ALP)活性,通過(guò)PT-PCR檢測(cè)ALP、Runx2、Col-1基因的表達(dá);成骨誘導(dǎo)21天后,分別對(duì)3個(gè)組hDFSCs形成的鈣結(jié)節(jié)進(jìn)行茜素紅染色。4.作用機(jī)制研究:成骨分化實(shí)驗(yàn)分為6個(gè)組:(1)control-0μM GW4869;(2)control-10μM GW4869;(3)control-20μM GW4869;(4)LIPUS-0μM GW4869;(5)LIPUS-10μM GW4869;(6)LIPUS-20μM GW4869。用不同濃度(0μM,10μM,20μM)中性鞘磷脂酶抑制劑GW4869處理hDFSCs,第4-6組每天LIPUS輻照處理細(xì)胞,1-3組作為對(duì)照。成骨誘導(dǎo)7天后,通過(guò)ALP染色和RT-PCR檢測(cè)hDFSCs成骨分化能力。炎癥抑制實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)組:(1)control;(2)LPS;(3)LIPUS;(4)LIPUS+LPS;(5)LIPUS+LPS+GW4869。使用20μM GW4869抑制外泌體分泌,加入LPS刺激炎癥因子分泌,LIPUS處理細(xì)胞后通過(guò)RT-PCR檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)。促分泌實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)組:(1)GW4869;(2)GW4869+LIPUS。使用20μM GW4869抑制hDFSCs分泌外泌體后,第2組采用LIPUS儀處理細(xì)胞30min,第1組作為對(duì)照。通過(guò)WB檢測(cè)外泌體分泌相關(guān)蛋白的的表達(dá)。結(jié)果:1.原代及傳代后的hDFSCs呈不規(guī)則長(zhǎng)梭形,可以在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出成脂和成骨分化的能力。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明hDFSCs可陽(yáng)性表達(dá)CD90、CD105和CD146,陰性表達(dá)CD31和CD45。所以hDFSCs是具備多向分化潛能的間充質(zhì)來(lái)源干細(xì)胞。2.超速離心法提取未經(jīng)LIPUS處理和LIPUS處理后hDFSCs分泌的外泌體(con-Exo和LIPUS-Exo),蛋白質(zhì)印跡法證實(shí)外泌體表面標(biāo)記蛋白CD9、CD63、TSG101為陽(yáng)性,Calnexin為陰性;LIPUS-Exo蛋白表達(dá)量高于con-Exo;透射電鏡下觀(guān)察到兩種外泌體呈雙層膜碟狀結(jié)構(gòu);納米顆粒跟蹤分析技術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)con-Exo和LIPUS-Exo平均粒徑符合外泌體粒徑范圍,相同細(xì)胞量提取的外泌體中LIPUS-Exo濃度大于con-Exo濃度;激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察到經(jīng)PKH26熒光標(biāo)記的外泌體在與hDFSCs共培養(yǎng)以后,可以經(jīng)細(xì)胞膜內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞,并分布于細(xì)胞質(zhì)。3.CCK8試驗(yàn)證明,con-Exo和LIPUS-Exo處理均可使hDFSCs增殖活性增強(qiáng)。成骨誘導(dǎo)7天后,外泌體處理組的ALP染色明顯深于對(duì)照組。同時(shí),外泌體處理可顯著增強(qiáng)hDFSCs的ALP活性,并促進(jìn)成骨相關(guān)基因ALP、Runx2、Col-1的表達(dá)。成骨誘導(dǎo)21天后,外泌體處理組的鈣結(jié)節(jié)形成能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組。LIPUS-Exo促進(jìn)hDFSCs增殖和成骨分化的作用強(qiáng)于con-Exo。4.在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件下使用不同濃度(0μM,10μM,20μM)的GW4869處理hDFSCs,7天后進(jìn)行ALP染色,細(xì)胞染色深度呈濃度依賴(lài)性降低;成骨誘導(dǎo)期間進(jìn)行了LIPUS輻照處理的hDFSCs染色深度強(qiáng)于未作LIPUS處理的細(xì)胞。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件下,使用不同濃度的GW4869處理細(xì)胞后,成骨相關(guān)基因表達(dá)量呈濃度依賴(lài)性降低;LIPUS處理可使相應(yīng)組成骨相關(guān)基因表達(dá)量升高。LPS刺激引起了hDFSCs炎癥因子IL-8的表達(dá);使用GW4869抑制hDFSCs外泌體分泌后,IL-8表達(dá)量進(jìn)一步升高;增加誘導(dǎo)因素LIPUS可使hDFSCs的IL-8表達(dá)量降低。WB結(jié)果顯示,經(jīng)GW4869處理后,hDFSCs外泌體分泌相關(guān)蛋白表達(dá)量較低,而進(jìn)行LIPUS輻照處理后,外泌體分泌相關(guān)蛋白表達(dá)量升高。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)證明LIPUS誘導(dǎo)的hDFSCs來(lái)源外泌體可以通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入hDFSCs內(nèi),促進(jìn)hDFSCs的增殖和成骨分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LIPUS對(duì)hDFSCs成骨分化的促進(jìn)作用可能部分歸因于其增加了hDFSCs外泌體分泌相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)hDFSCs外泌體分泌,以及抑制了炎癥反應(yīng)。hDFSCs來(lái)源廣泛,具有牙周組織分化潛能,且hDFSCs外泌體容易儲(chǔ)存和移植,具有較低的免疫原性,可以為牙周再生提供新思路。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類(lèi)】：R781.05
【部分圖文】：

1hDFSCs的原代和傳代培養(yǎng)（40×）

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文18Figure1-2.1TheprimarycultureandsubcultureofhDFSCs（40×）A:原代hDFSCs從組織周?chē)_(kāi)始成長(zhǎng)，逐漸長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)瓶B:第3代hDFSCs，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形結(jié)構(gòu)2.2人牙囊干細(xì)胞（hDFSCs）多向分化能力鑒定在成骨誘導(dǎo)21天后，hDFSCs呈緊密、多層重疊的立體結(jié)構(gòu)，并且肉眼可見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)。茜素紅染色后，鏡下觀(guān)察可見(jiàn)細(xì)胞間有紅色的礦化結(jié)節(jié)（圖1-2.2A）。在成脂誘導(dǎo)23天后，hDFSCs形態(tài)變?yōu)槎嘟切�，鏡下可見(jiàn)白色脂滴。油紅O染色后，鏡下觀(guān)察可見(jiàn)橙紅色脂滴（圖1-2.2B）。圖1-2.2hDFSCs的多向分化能鑒定（40×）Figure1-2.2ThedetectionofmultipotentialdifferentiationabilityofhDFSCs（40×）A:成骨誘導(dǎo)后茜素紅染可見(jiàn)紅鈣結(jié)節(jié)B:成脂誘導(dǎo)后油紅O染可見(jiàn)橘紅脂滴2.3人牙囊干細(xì)胞（hDFSCs）分子表型鑒定流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示hDFSCs分子表型為：間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面抗原表達(dá)：CD90：99.59%（圖1-2.3C）；CD105：76.56%（圖1-2.3D）；CD146：59.50%（圖1-2.3E）；造血系細(xì)胞表面抗原表達(dá)：CD31：0.33%（圖1-2.3A）；CD45：0.70%（圖1-2.3B）。此結(jié)果表明，hDFSCs為間充質(zhì)來(lái)源，且有干細(xì)胞特性。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文19圖1-2.3hDFSCs的分表型的流式細(xì)胞術(shù)鑒定Figure1-2.3ThemolecularphenotypeidentificationofhDFSCsbyflowcytometryA:CD31分表型B:CD45分表型C:CD90分表型D:CD105分表型E:CD146分表型3討論牙囊是與牙齒萌出和發(fā)育相關(guān)的、圍繞在牙胚周?chē)氖杷山Y(jié)締組織。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，圍繞在下頜前磨牙牙胚的牙囊在牙齒的萌出過(guò)程中起關(guān)鍵作用，如果沒(méi)有牙囊的存在，牙齒就無(wú)法萌出[37]。已有研究成功分離出人牙囊細(xì)胞，且該細(xì)胞呈紡錘形結(jié)構(gòu)，旋渦狀排列，細(xì)胞質(zhì)清亮，可貼壁生長(zhǎng)，具有成纖維細(xì)胞特性[38]。hDFSCs具有較高的增殖能力，熱壓環(huán)境可以增強(qiáng)其增殖能力[39]。此外,hDFSCs具有干細(xì)胞特性，在一定條件下可以向成骨、成脂和軟骨細(xì)胞分化[40]。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，hDFSCs的CD146表達(dá)量較高。CD146是間充質(zhì)干細(xì)胞早期標(biāo)志物，因此hDFSCs具有較強(qiáng)的克隆形成能力和多向分化能力[41]。牙囊細(xì)胞常作為種子細(xì)胞或輔助其他種子細(xì)胞進(jìn)行牙周再生。有學(xué)者利用細(xì)胞膜片技術(shù)延長(zhǎng)了細(xì)胞的存活時(shí)間，使其在相對(duì)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)持續(xù)釋放生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)牙周再生[34]。也有研究者將牙囊細(xì)胞與健康成人和牙周炎患者的牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)牙囊細(xì)胞可使兩種hPDLSCs的多向分化能力及自我更新能力增強(qiáng)[42]。
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 丁濤;程力;朱浩明;褚亞偉;金磊;;低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)人脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)矯形外科雜志;2014年11期

2 李云霞;;牙周病的病因及臨床治療研究進(jìn)展[J];河北醫(yī)學(xué);2013年03期

3 張超;程祥榮;;成體人牙囊細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2013年02期

4 毛強(qiáng);俞楠澤;江彬峰;童培建;楊永宏;;非手術(shù)治療骨不連的現(xiàn)狀及進(jìn)展[J];中國(guó)骨傷;2010年11期

5 潘瑋敏;王兵;;低強(qiáng)度脈沖超聲波促進(jìn)青年足球運(yùn)動(dòng)員疲勞性骨折愈合研究[J];陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年03期

6 金作林,林珠;人牙囊細(xì)胞的培養(yǎng)及其特性[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2002年04期

本文編號(hào)：2884918