目的:(1)去勢(shì)(OVX)合D-半乳糖(D-gal)腹腔注射12周制備阿爾茨海默癥樣大鼠;(2)觀察艾灸腎俞穴對(duì)AD樣大鼠神經(jīng)元丟失的保護(hù)效應(yīng)及其對(duì)ERK1/2信號(hào)通路(細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2通路)的影響;(3)研究艾灸腎俞穴通過激活海馬區(qū)ERK/CREB信號(hào)通路改善AD樣大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)元丟失的機(jī)理。方法:實(shí)驗(yàn)一將12周齡雌性未孕SD大鼠30只隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和模型組,每組10只。模型組摘除雙側(cè)卵巢,術(shù)后3d,每日按照150mg/kg/d劑量腹腔注射D-gal。假手術(shù)組僅摘除卵巢周圍脂肪,每日按照同等劑量腹腔注射0.9%生理鹽水,兩組均注射12周,術(shù)后24h、12周El IS A法檢測(cè)血清雌激素水平,12周后進(jìn)行Morris水迷宮、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、糖水偏好實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)檢測(cè),免疫組化法檢測(cè)海馬Aβ1-42表達(dá)水平,免疫印跡法檢測(cè)海馬區(qū)tau蛋白在PHF-1位點(diǎn)的磷酸化水平;實(shí)驗(yàn)二選用12周齡SD雌性未孕大鼠60只,隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、腎俞組、胃俞組、非經(jīng)非穴組,每組10只。除正常組和假手術(shù)組外,其它4組均摘除雙側(cè)卵巢,術(shù)后3d,每日按照150mg/kg/d劑量腹腔注射D-gal(D-半乳糖)90d建立阿爾茨海默病樣大鼠模型,假手術(shù)組干預(yù)方法同實(shí)驗(yàn)一。腎俞組、胃俞組、非經(jīng)非穴組自卵巢切除術(shù)后第3d起,采用直徑約6mm定制艾條,分別于雙側(cè)“腎俞”、“胃俞”、“非經(jīng)非穴”距離皮膚上2~3cm處懸灸,使局部溫度維持在41±0.5℃,每穴10min,每日9:00am開始治療,每日1次,5日為1療程,療程間休息2日,共治療12個(gè)療程。正常組和假手術(shù)組不艾灸,但以相同的方式束縛處理。水迷宮檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,免疫組化法檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)Aβ1-42和雌激素受體α表達(dá),尼氏染色分析各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)目及形態(tài)變化,免疫印跡法檢測(cè)各組大鼠海馬區(qū)p-CREB、p-ERK、ERK、CREB的蛋白表達(dá),ELISA法檢測(cè)各組大鼠術(shù)后24h和干預(yù)結(jié)束后血清雌二醇水平;實(shí)驗(yàn)三將12周齡SD雌性未孕大鼠40只,隨機(jī)分為正常組、模型組、腎俞組、抑制劑組,每組10只。除正常組外,其它3組均摘除雙側(cè)卵巢,術(shù)后3d,每日按照150mg/kg/d劑量腹腔注射D-gal90d建立AD樣大鼠模型,腎俞組、抑制劑組自卵巢切除術(shù)后第3d起,分別于雙側(cè)“腎俞”穴距離皮膚上方1~2cm處懸灸,艾灸方法和時(shí)間同實(shí)驗(yàn)二。抑制劑組干預(yù)方法在腎俞組基礎(chǔ)上每周皮下注射選擇性ERα受體拮抗劑甲基哌啶吡唑(MPP),劑量為0.25mg/kg體重,皮下注射,1次/w,共12w。其他各組干預(yù)方法同實(shí)驗(yàn)二,檢測(cè)指標(biāo)同實(shí)驗(yàn)二。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一水迷宮顯示:各組逃避潛伏期均呈現(xiàn)隨時(shí)間推移而下降。從學(xué)習(xí)階段Day2起,與正常組相比,模型組連續(xù)5天逃避潛伏期均明顯延長。在第14天記憶檢測(cè)階段,與正常組比較,模型組連續(xù)穿越平臺(tái)次數(shù)明顯下降(P0.001);曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)顯示,與假手術(shù)組和正常組比較,模型組上肢上抬次數(shù)、5min內(nèi)移動(dòng)時(shí)間和總距離明顯下降(P0.01),5min內(nèi)穿越格子數(shù)明顯下降(P0.01)。糖水偏好實(shí)驗(yàn)顯示,模型組糖水偏好率明顯低于假手術(shù)組和正常組(P0.01)。血清雌二醇ELISA結(jié)果顯示:與假手術(shù)組和正常組比較,模型組血清雌二醇水平在術(shù)后24h以及12周后均明顯降低(P0.01)。免疫組化結(jié)果顯示:模型組海馬區(qū)Aβ1-42表達(dá)較假手術(shù)組和正常組均明顯增多(P0.01);免疫印跡結(jié)果顯示:模型組tau蛋白磷酸化水平較假手術(shù)組和正常組均明顯增多(P0.01);實(shí)驗(yàn)二結(jié)果:與正常組比較,假手術(shù)組各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯差異。各組逃避潛伏期均呈現(xiàn)隨時(shí)間推移而下降。造模后,與正常組比較,從學(xué)習(xí)階段Day2起,模型組連續(xù)5天逃避潛伏期均明顯延長(P0.001),穿越平臺(tái)次數(shù)明顯下降(P0.001),海馬區(qū)Aβ1-42表達(dá)明顯增多(P0.001),神經(jīng)元排列紊亂,著色較淺,胞體呈空泡狀,以海馬CA1、CA3區(qū)為主的尼氏小體數(shù)量明顯下降(p0.001),P-ERK/ERK、P-CREB/CREB水平明顯下降(P0.001),雌二醇水平明顯下降(P0.001);經(jīng)過12周艾灸治療后,與模型組比較,腎俞組連續(xù)5天逃避潛伏期明顯縮短(P0.01),海馬內(nèi)Aβ1-42表達(dá)明顯減少(P0.01),且腎俞組Aβ1-42表達(dá)明顯低于胃俞組和非經(jīng)非穴組(P0.01,P0.01)。各組ERK和CREB總量沒有明顯差異;腎俞組和胃俞組海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目明顯升高(p0.05,p0.01),腎俞組P-ERK/ERK、P-CREB/CREB水平明顯上升(P0.001,P0.001),胃俞組P-ERK/ERK、P-CREB/CREB水平明顯上升(P0.01,P0.05);腎俞組逃避潛伏期明顯短于胃俞組和非經(jīng)非穴組(P0.05),海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目明顯高于胃俞組和非經(jīng)非穴組(p0.01),P-ERK/ERK、P-CREB/CREB水平明顯高于胃俞組和非經(jīng)非穴組(P0.05,P0.01);實(shí)驗(yàn)三干預(yù)三個(gè)月后結(jié)果,各組海馬組織中ERK和CREB總量沒有明顯差異,各組逃避潛伏期均呈現(xiàn)隨時(shí)間推移而下降。從學(xué)習(xí)階段Day2起,與正常組相比,模型組連續(xù)5天逃避潛伏期均明顯延長(P0.001),穿越平臺(tái)次數(shù)明顯下降(P0.01),海馬區(qū)Aβ1-42表達(dá)明顯增多(P0.001),海馬區(qū)神經(jīng)元排列紊亂,著色較淺,胞體多呈空泡狀,尼氏小體數(shù)量稀少,以CA1、CA3區(qū)為主神經(jīng)元數(shù)目明顯下降(p0.001),PERK和P-CREB水平明顯下降(P0.001),海馬區(qū)ERα表達(dá)明顯減少(P0.01);經(jīng)治療后第3天起,與模型組相比,腎俞組穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P0.01),連續(xù)5天逃避潛伏期明顯縮短(P0.001),海馬內(nèi)Aβ1-42表達(dá)明顯減少(P0.001),CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目明顯增加(p0.01),P-ERK/T-ERK、P-CREB/T-CREB水平明顯增加(P0.001),海馬區(qū)ERα表達(dá)明顯升高(P0.05);與腎俞組比較,抑制劑組連續(xù)5天逃避潛伏期明顯呈延長趨勢(shì),穿越平臺(tái)次數(shù)明顯下降(P0.01),Aβ1-42表達(dá)明顯升高(P0.001),CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目組明顯少于腎俞組和正常組(p0.05,p0.01),P-ERK/T-ERK、P-CREB/T-CREB水平明顯增加(P0.01,P0.05)且ERα表達(dá)明顯低于腎俞組(P0.01)。結(jié)論:VOX合D-gal注射大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力減退,并伴有抑郁癥狀,且Aβ淀粉樣蛋白和磷酸化tau蛋白含量明顯增多,是一種較理想的老年性癡呆樣動(dòng)物模型;艾灸腎俞穴改善AD樣大鼠的神經(jīng)元丟失現(xiàn)象、Aβ異常沉積,其保護(hù)神經(jīng)元效應(yīng)可能與激活海馬區(qū)ERK1/2信號(hào)通路有關(guān);艾灸腎俞穴可能通過激活A(yù)D樣大鼠海馬區(qū)ERα依賴的ERK/CREB信號(hào)通路改善去卵巢合D-半乳糖腹腔注射誘導(dǎo)AD樣大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)元丟失現(xiàn)象。
【學(xué)位單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R245.8
【部分圖文】：

各組大鼠運(yùn)動(dòng)速度（m/s）

圖 1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)速度（m/s） 2.1.2 定位航行實(shí)驗(yàn) 造模后，各組逃避潛伏期均呈現(xiàn)隨時(shí)間推移而下降，正常組和假手術(shù)組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從學(xué)習(xí)階段 Day2 起，與正常組相比，模型組連續(xù) 5天逃避潛伏期均明顯延長（Ｐ＜0.05），說明模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力持續(xù)下降。（見表１圖 2）

艾灸腎俞穴對(duì)去卵巢合D-半乳糖注射AD樣大鼠早期干預(yù)的效應(yīng)研究142.1.3各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)如圖3所示，正常組和假手術(shù)組穿越平臺(tái)次數(shù)無明顯差異。與正常組比較，模型組連續(xù)穿越平臺(tái)次數(shù)明顯下降（Ｐ＜0.001），說明模型組大鼠記憶能力下降（見表2，圖3）表2各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較(±s)(次)組別正常組假手術(shù)組模型組次數(shù)（次）7.0±1.06.0±1.62.0±1.0***注：與正常組比較*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;圖3各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)結(jié)果比較(±s)(次)注：與正常組比較*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.2.1.4各組大鼠水迷宮空間探索運(yùn)行軌跡各組大鼠呈現(xiàn)不同特點(diǎn)運(yùn)動(dòng)軌跡：正常組和假手術(shù)組呈現(xiàn)“趨向式”搜索策略，模型組呈現(xiàn)AD樣大鼠模型常見的“邊緣式”搜索策略；見圖4。Day14VOX+D-galShamCon圖4各組大鼠水迷宮運(yùn)行軌跡比較
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2882610