發(fā)布時間：2020-11-10 13:08

　　 目的:疼痛是患者求醫(yī)最常見的原因之一。盡管不會立即威脅生命,但慢性疼痛會使人遭受巨大的痛苦。國際疼痛協(xié)會對疼痛的最新定義為“疼痛是一種由組織損傷或潛在的組織損傷引起的相關(guān)感覺、情緒、認(rèn)知和社會維度的痛苦體驗”。疼痛的感覺分辨和情緒體驗由不同的神經(jīng)通路傳導(dǎo)。大量研究表明,ACC參與編碼痛情緒反應(yīng)。離子型谷氨酸受體包括NMDA受體和非NMDA受體(AMPA和KA受體),其中NMDA受體被認(rèn)為參與疼痛的情感維度的處理。阿片受體是鎮(zhèn)痛、成癮和情緒障礙的重要藥物靶標(biāo)。ACC腦區(qū)中的阿片受體主要有μ-、δ-和κ-阿片受體。本實驗室的前期研究從行為學(xué)、蛋白水平以及多通道電生理記錄證實了大鼠腳掌注射CFA可引起ACC腦區(qū)NMDA受體磷酸化水平增高,神經(jīng)元的興奮性升高,從而誘導(dǎo)大鼠的痛厭惡情緒;激活A(yù)CC腦區(qū)κ-阿片受體,可下調(diào)NMDA受體的磷酸化水平,降低神經(jīng)元的興奮性,緩解痛厭惡情緒。然而,腳掌注射CFA引起ACC腦區(qū)神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)是否為NMDA電流增強(qiáng)所致?激活κ-阿片受體后是否通過抑制了NMDA電流降低了神經(jīng)元的興奮性?目前還沒有確切的證據(jù)。因此,本研究旨在利用給大鼠腳掌注射CFA建立的慢痛模型,利用腦片膜片鉗技術(shù)記錄大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元NMDA電流的變化,進(jìn)一步探討ACC腦區(qū)神經(jīng)元興奮性與NMDA電流變化的關(guān)系,以及激活κ-阿片受體對NMDA電流的影響。方法:1.選取雄性SD大鼠(10~20天),腳掌注射0.08 ml完全弗氏佐劑(CFA)混合液,建立炎性疼痛模型。對照組相同部位注射0.08 ml生理鹽水(NS)。2.制備SD大鼠包含ACC區(qū)域的腦片(250μm),利用可視膜片鉗法選擇狀態(tài)好的神經(jīng)元。將細(xì)胞膜電位鉗制在+40mV,利用刺激電極誘導(dǎo)并記錄其NMDA電流,比較CFA組大鼠與對照組大鼠NMDA電流的幅度是否有差異。3.將細(xì)胞膜電位鉗制在+40mV,利用刺激電極誘導(dǎo)并記錄ACC腦區(qū)神經(jīng)元的AMPA電流,比較CFA組大鼠與對照組大鼠AMPA電流的幅度是否有差異。4.在Gap-free模式下記錄ACC腦區(qū)錐體神經(jīng)元的自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSP),比較CFA組大鼠與對照組大鼠sEPSP的發(fā)放頻率與幅度是否有差異。5.在腦片灌流液中添加不同濃度(10~-1212 mol/L、10~-99 mol/L、10~-66 mol/L)的κ-阿片受體激動劑Dynorphin A,觀察其對CFA組大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的NMDA電流及AMPA電流的影響。6.在電極內(nèi)液中添加熒光染料使神經(jīng)元著色,觀察所記錄細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果:1.將膜電位鉗制在+40 mV時,刺激電極可誘導(dǎo)大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生外向電流。向灌流液中加入AMPA/KA受體拮抗劑CNQX(20μmol/L)和GABA受體拮抗劑Bicuculline(100μmol/L),電流幅度部分減小;再向灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP-5(100μmol/L),可見電流被全部抑制,說明后一部分被AP-5抑制的電流為NMDA電流。若向灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP-5(100μmol/L)和GABA受體拮抗劑Bicuculline(100μmol/L),電流大部分被抑制;再向灌流液中加入AMPA/KA受體拮抗劑CNQX(20μmol/L),可見電流被全部抑制,說明后一部分被CNQX抑制的電流為AMPA電流。2.將膜電位鉗制在+40 mV,灌流液中加入AMPA/KA受體拮抗劑CNQX(20μmol/L)和GABA受體拮抗劑Bicuculline(100μmol/L)后,可記錄到刺激電極誘導(dǎo)的大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的NMDA電流。腳掌注射CFA組大鼠與對照組大鼠相比,ACC腦區(qū)神經(jīng)元的NMDA電流的幅度顯著增加(P0.05,n=5)。3.將膜電位鉗制在+40 mV,灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP-5(100μmol/L)和GABA受體拮抗劑Bicuculline(100μmol/L),可記錄到刺激電極誘導(dǎo)的ACC腦區(qū)神經(jīng)元的AMPA電流。腳掌注射CFA組大鼠與對照組大鼠相比,ACC腦區(qū)神經(jīng)元的AMPA電流的幅度改變無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05,n=5)。4.Gap-free模式下記錄細(xì)胞的自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSP),CFA組大鼠與對照組大鼠相比ACC腦區(qū)神經(jīng)元的sEPSP的發(fā)放頻率與幅度顯著增加。5.選取CFA組大鼠腦片中的細(xì)胞,將膜電位鉗制在+40 mV下,灌流液中加入AMPA/KA受體拮抗劑CNQX(20μmol/L)和GABA受體拮抗劑Bicuculline(100μmol/L)后,可記錄到刺激電極誘導(dǎo)的大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的NMDA電流。灌流液中加入不同濃度的κ-阿片受體激動劑Dynorphin A,發(fā)現(xiàn)10~-1212 mol/L的Dynorphin A對NMDA電流沒有明顯影響;10~-99 mol/L的Dynorphin A可降低CFA組大鼠NMDA電流的幅度(P0.05,n=5),10~-66 mol/L的Dynorphin A降低CFA組大鼠NMDA電流幅度的效果更顯著(P0.01,n=5),說明隨著κ-阿片受體激動劑濃度的增加,NMDA電流被抑制的程度也逐漸增加。6.選取CFA組大鼠腦片中狀態(tài)好的細(xì)胞,將膜電位鉗制在+40 mV,灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP-5(100μmol/L)和GABA受體拮抗劑Bicuculline(100μmol/L)后,可記錄到刺激電極誘導(dǎo)的大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的AMPA電流。灌流液中加入不同濃度(10~(-12)mol/L、10~(-9)mol/L、10~(-6)mol/L)的κ-阿片受體激動劑Dynorphin A對CFA組大鼠AMPA電流的影響無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05,n=5),說明激活κ-阿片受體對AMPA電流無明顯作用。7.大鼠ACC區(qū)域的腦片熒光染色后可清晰地觀察到實驗中所記錄神經(jīng)元的胞體、軸突及樹突呈現(xiàn)綠色熒光。結(jié)論:大鼠腳掌注射CFA引起ACC腦區(qū)NMDA受體(而不是AMPA受體)介導(dǎo)的電流幅度顯著增加,是提高該區(qū)域神經(jīng)元興奮性的原因;而激活κ-阿片受體減小NMDA電流的幅度,可降低神經(jīng)元的興奮性。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R402
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)（博）碩士學(xué)位論文6溫（25℃）孵育液中。切片液和孵育液中都持續(xù)通混合氣（95％O2和5％CO2）。切好的腦片孵育1小時即可觀察記錄。如圖1所示。圖1大鼠離體腦片標(biāo)本制備A：將大鼠斷頭，掀起顱骨，剝?nèi)ツX膜后取出的腦組織；B：用刀片切去多余部分后的腦組織；C：用冰夾使溶解狀態(tài)的瓊脂凝固從而固定腦組織；D：沿冠狀切面切取腦片，切片槽周圍放置冰袋降溫，切片液中持續(xù)通混合氣（95％O2和5％CO2）。1.5.3微電極的拉制微電極所用的玻璃管選擇美國Sutter公司的硼硅酸鹽玻璃管，外徑為1.5mm，內(nèi)徑為0.86mm，帶芯，有利于充灌電極尖端。在P-97微電極拉制儀上設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，首先對玻璃、管進(jìn)行坡度測試，然后在此基礎(chǔ)上設(shè)置加熱值、氣體壓強(qiáng)、拉制桿移動速度、制冷空氣釋放的時間長度等。采用三步拉制法，將玻璃管拉成尖端較胖的電極，易于封接。用事先配置好的電極內(nèi)液充灌時，先在電極靠后的部分注入少許內(nèi)液，利用虹吸作用使尖端充滿，之后再將內(nèi)液充灌到電極的1/3處，指尖輕彈電極，去除電極尖端殘留的氣泡，測試電極的阻抗，在5～8MΩ，即為適合實驗記錄的玻璃微電極。1.5.4腦片膜片鉗記錄膜片鉗技術(shù)是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細(xì)胞膜單一的或多個

山西醫(yī)科大學(xué)（博）碩士學(xué)位論文92結(jié)果2.1刺激電極可誘導(dǎo)大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的NMDA電流和AMPA電流將膜電位鉗制在+40mV下時，刺激電極可誘導(dǎo)大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的外向電流。在灌流液中加入AMPA受體拮抗劑CNQX（20μmol/L）和GABA受體拮抗劑Bicuculline（100μmol/L），可記錄到較大的電流；繼續(xù)加入AP-5（100μmol/L），可見電流被全部抑制，沖洗掉AP-5后電流恢復(fù)，證明該電流為NMDA電流，如圖2所示。若在灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP-5（100μmol/L）和GABA受體拮抗劑Bicuculline（100μmol/L），可記錄到一較小電流；繼續(xù)加入AMPA受體拮抗劑CNQX（20μmol/L），可見該電流被全部抑制；沖洗掉CNQX后電流恢復(fù)，證明該電流為AMPA電流。如圖3所示。圖2刺激電極誘導(dǎo)的大鼠ACC腦區(qū)NMDA電流A：將膜電位鉗制在+40mV，刺激電極誘導(dǎo)的ACC腦區(qū)神經(jīng)元的外向電流；B：膜電位鉗制在+40mV，腦片灌流液中添加AMPA受體拮抗劑CNQX和GABA受體拮抗劑Bicuculline后的所鉗制細(xì)胞的電流變化；C：在B的基礎(chǔ)上向腦片灌流液中添加NMDA受體拮抗劑AP-5后所鉗制細(xì)胞的電流被完全抑制；D：沖洗掉AP-5后電流恢復(fù)。

山西醫(yī)科大學(xué)（博）碩士學(xué)位論文10圖3刺激電極誘導(dǎo)的大鼠ACC腦區(qū)AMPA電流A：膜電位鉗制在+40mV，刺激電極誘導(dǎo)的ACC腦區(qū)神經(jīng)元的外向電流；B：膜電位鉗制在+40mV下，腦片灌流液中添加NMDA受體拮抗劑AP-5和GABA受體拮抗劑Bicuculline后所鉗制細(xì)胞的電流變化；C：在B的基礎(chǔ)上向灌流液中添加AMPA受體拮抗劑CNQX后電流被完全抑制；D：沖洗掉CNQX后電流恢復(fù)。2.2CFA組大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元NMDA電流幅度增加腦片灌流液中加入AMPA受體拮抗劑CNQX（20μmol/L）和GABA受體拮抗劑Bicuculline（100μmol/L），將細(xì)胞膜電位鉗制在+40mV，可記錄到ACC區(qū)神經(jīng)元的NMDA電流。CFA組大鼠與NS組大鼠ACC區(qū)神經(jīng)元NMDA電流的幅度相比明顯減�。–FA組372.6±26.72pAvs對照組258.6±40.38pA，P<0.05，n=5），如圖4所示。
【參考文獻(xiàn)】

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1 代潔瓊;電針激活大鼠前扣帶皮層κ-阿片受體緩解痛情緒的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2018年

2 賈欣;激活前扣帶皮層κ-阿片受體對緩解大鼠痛情緒作用的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號：2877964