目的:疼痛是患者求醫(yī)最常見的原因之一。盡管不會立即威脅生命,但慢性疼痛會使人遭受巨大的痛苦。國際疼痛協(xié)會對疼痛的最新定義為“疼痛是一種由組織損傷或潛在的組織損傷引起的相關感覺、情緒、認知和社會維度的痛苦體驗”。疼痛的感覺分辨和情緒體驗由不同的神經(jīng)通路傳導。大量研究表明,ACC參與編碼痛情緒反應。離子型谷氨酸受體包括NMDA受體和非NMDA受體(AMPA和KA受體),其中NMDA受體被認為參與疼痛的情感維度的處理。阿片受體是鎮(zhèn)痛、成癮和情緒障礙的重要藥物靶標。ACC腦區(qū)中的阿片受體主要有μ-、δ-和κ-阿片受體。本實驗室的前期研究從行為學、蛋白水平以及多通道電生理記錄證實了大鼠腳掌注射CFA可引起ACC腦區(qū)NMDA受體磷酸化水平增高,神經(jīng)元的興奮性升高,從而誘導大鼠的痛厭惡情緒;激活ACC腦區(qū)κ-阿片受體,可下調(diào)NMDA受體的磷酸化水平,降低神經(jīng)元的興奮性,緩解痛厭惡情緒。然而,腳掌注射CFA引起ACC腦區(qū)神經(jīng)元興奮性增強是否為NMDA電流增強所致?激活κ-阿片受體后是否通過抑制了NMDA電流降低了神經(jīng)元的興奮性?目前還沒有確切的證據(jù)。因此,本研究旨在利用給大鼠腳掌注射CFA建立的慢痛模型,利用腦片膜片鉗技術記錄大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元NMDA電流的變化,進一步探討ACC腦區(qū)神經(jīng)元興奮性與NMDA電流變化的關系,以及激活κ-阿片受體對NMDA電流的影響。方法:1.選取雄性SD大鼠(10~20天),腳掌注射0.08 ml完全弗氏佐劑(CFA)混合液,建立炎性疼痛模型。對照組相同部位注射0.08 ml生理鹽水(NS)。2.制備SD大鼠包含ACC區(qū)域的腦片(250μm),利用可視膜片鉗法選擇狀態(tài)好的神經(jīng)元。將細胞膜電位鉗制在+40mV,利用刺激電極誘導并記錄其NMDA電流,比較CFA組大鼠與對照組大鼠NMDA電流的幅度是否有差異。3.將細胞膜電位鉗制在+40mV,利用刺激電極誘導并記錄ACC腦區(qū)神經(jīng)元的AMPA電流,比較CFA組大鼠與對照組大鼠AMPA電流的幅度是否有差異。4.在Gap-free模式下記錄ACC腦區(qū)錐體神經(jīng)元的自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSP),比較CFA組大鼠與對照組大鼠sEPSP的發(fā)放頻率與幅度是否有差異。5.在腦片灌流液中添加不同濃度(10~-1212 mol/L、10~-99 mol/L、10~-66 mol/L)的κ-阿片受體激動劑Dynorphin A,觀察其對CFA組大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的NMDA電流及AMPA電流的影響。6.在電極內(nèi)液中添加熒光染料使神經(jīng)元著色,觀察所記錄細胞的形態(tài)。結果:1.將膜電位鉗制在+40 mV時,刺激電極可誘導大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生外向電流。向灌流液中加入AMPA/KA受體拮抗劑CNQX(20μmol/L)和GABA受體拮抗劑Bicuculline(100μmol/L),電流幅度部分減小;再向灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP-5(100μmol/L),可見電流被全部抑制,說明后一部分被AP-5抑制的電流為NMDA電流。若向灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP-5(100μmol/L)和GABA受體拮抗劑Bicuculline(100μmol/L),電流大部分被抑制;再向灌流液中加入AMPA/KA受體拮抗劑CNQX(20μmol/L),可見電流被全部抑制,說明后一部分被CNQX抑制的電流為AMPA電流。2.將膜電位鉗制在+40 mV,灌流液中加入AMPA/KA受體拮抗劑CNQX(20μmol/L)和GABA受體拮抗劑Bicuculline(100μmol/L)后,可記錄到刺激電極誘導的大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的NMDA電流。腳掌注射CFA組大鼠與對照組大鼠相比,ACC腦區(qū)神經(jīng)元的NMDA電流的幅度顯著增加(P0.05,n=5)。3.將膜電位鉗制在+40 mV,灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP-5(100μmol/L)和GABA受體拮抗劑Bicuculline(100μmol/L),可記錄到刺激電極誘導的ACC腦區(qū)神經(jīng)元的AMPA電流。腳掌注射CFA組大鼠與對照組大鼠相比,ACC腦區(qū)神經(jīng)元的AMPA電流的幅度改變無統(tǒng)計學差異(P0.05,n=5)。4.Gap-free模式下記錄細胞的自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSP),CFA組大鼠與對照組大鼠相比ACC腦區(qū)神經(jīng)元的sEPSP的發(fā)放頻率與幅度顯著增加。5.選取CFA組大鼠腦片中的細胞,將膜電位鉗制在+40 mV下,灌流液中加入AMPA/KA受體拮抗劑CNQX(20μmol/L)和GABA受體拮抗劑Bicuculline(100μmol/L)后,可記錄到刺激電極誘導的大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的NMDA電流。灌流液中加入不同濃度的κ-阿片受體激動劑Dynorphin A,發(fā)現(xiàn)10~-1212 mol/L的Dynorphin A對NMDA電流沒有明顯影響;10~-99 mol/L的Dynorphin A可降低CFA組大鼠NMDA電流的幅度(P0.05,n=5),10~-66 mol/L的Dynorphin A降低CFA組大鼠NMDA電流幅度的效果更顯著(P0.01,n=5),說明隨著κ-阿片受體激動劑濃度的增加,NMDA電流被抑制的程度也逐漸增加。6.選取CFA組大鼠腦片中狀態(tài)好的細胞,將膜電位鉗制在+40 mV,灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP-5(100μmol/L)和GABA受體拮抗劑Bicuculline(100μmol/L)后,可記錄到刺激電極誘導的大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的AMPA電流。灌流液中加入不同濃度(10~(-12)mol/L、10~(-9)mol/L、10~(-6)mol/L)的κ-阿片受體激動劑Dynorphin A對CFA組大鼠AMPA電流的影響無統(tǒng)計學差異(P0.05,n=5),說明激活κ-阿片受體對AMPA電流無明顯作用。7.大鼠ACC區(qū)域的腦片熒光染色后可清晰地觀察到實驗中所記錄神經(jīng)元的胞體、軸突及樹突呈現(xiàn)綠色熒光。結論:大鼠腳掌注射CFA引起ACC腦區(qū)NMDA受體(而不是AMPA受體)介導的電流幅度顯著增加,是提高該區(qū)域神經(jīng)元興奮性的原因;而激活κ-阿片受體減小NMDA電流的幅度,可降低神經(jīng)元的興奮性。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R402
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學（博）碩士學位論文6溫（25℃）孵育液中。切片液和孵育液中都持續(xù)通混合氣（95％O2和5％CO2）。切好的腦片孵育1小時即可觀察記錄。如圖1所示。圖1大鼠離體腦片標本制備A：將大鼠斷頭，掀起顱骨，剝?nèi)ツX膜后取出的腦組織；B：用刀片切去多余部分后的腦組織；C：用冰夾使溶解狀態(tài)的瓊脂凝固從而固定腦組織；D：沿冠狀切面切取腦片，切片槽周圍放置冰袋降溫，切片液中持續(xù)通混合氣（95％O2和5％CO2）。1.5.3微電極的拉制微電極所用的玻璃管選擇美國Sutter公司的硼硅酸鹽玻璃管，外徑為1.5mm，內(nèi)徑為0.86mm，帶芯，有利于充灌電極尖端。在P-97微電極拉制儀上設置相應參數(shù)，首先對玻璃、管進行坡度測試，然后在此基礎上設置加熱值、氣體壓強、拉制桿移動速度、制冷空氣釋放的時間長度等。采用三步拉制法，將玻璃管拉成尖端較胖的電極，易于封接。用事先配置好的電極內(nèi)液充灌時，先在電極靠后的部分注入少許內(nèi)液，利用虹吸作用使尖端充滿，之后再將內(nèi)液充灌到電極的1/3處，指尖輕彈電極，去除電極尖端殘留的氣泡，測試電極的阻抗，在5～8MΩ，即為適合實驗記錄的玻璃微電極。1.5.4腦片膜片鉗記錄膜片鉗技術是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜單一的或多個

山西醫(yī)科大學（博）碩士學位論文92結果2.1刺激電極可誘導大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的NMDA電流和AMPA電流將膜電位鉗制在+40mV下時，刺激電極可誘導大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元的外向電流。在灌流液中加入AMPA受體拮抗劑CNQX（20μmol/L）和GABA受體拮抗劑Bicuculline（100μmol/L），可記錄到較大的電流；繼續(xù)加入AP-5（100μmol/L），可見電流被全部抑制，沖洗掉AP-5后電流恢復，證明該電流為NMDA電流，如圖2所示。若在灌流液中加入NMDA受體拮抗劑AP-5（100μmol/L）和GABA受體拮抗劑Bicuculline（100μmol/L），可記錄到一較小電流；繼續(xù)加入AMPA受體拮抗劑CNQX（20μmol/L），可見該電流被全部抑制；沖洗掉CNQX后電流恢復，證明該電流為AMPA電流。如圖3所示。圖2刺激電極誘導的大鼠ACC腦區(qū)NMDA電流A：將膜電位鉗制在+40mV，刺激電極誘導的ACC腦區(qū)神經(jīng)元的外向電流；B：膜電位鉗制在+40mV，腦片灌流液中添加AMPA受體拮抗劑CNQX和GABA受體拮抗劑Bicuculline后的所鉗制細胞的電流變化；C：在B的基礎上向腦片灌流液中添加NMDA受體拮抗劑AP-5后所鉗制細胞的電流被完全抑制；D：沖洗掉AP-5后電流恢復。

山西醫(yī)科大學（博）碩士學位論文10圖3刺激電極誘導的大鼠ACC腦區(qū)AMPA電流A：膜電位鉗制在+40mV，刺激電極誘導的ACC腦區(qū)神經(jīng)元的外向電流；B：膜電位鉗制在+40mV下，腦片灌流液中添加NMDA受體拮抗劑AP-5和GABA受體拮抗劑Bicuculline后所鉗制細胞的電流變化；C：在B的基礎上向灌流液中添加AMPA受體拮抗劑CNQX后電流被完全抑制；D：沖洗掉CNQX后電流恢復。2.2CFA組大鼠ACC腦區(qū)神經(jīng)元NMDA電流幅度增加腦片灌流液中加入AMPA受體拮抗劑CNQX（20μmol/L）和GABA受體拮抗劑Bicuculline（100μmol/L），將細胞膜電位鉗制在+40mV，可記錄到ACC區(qū)神經(jīng)元的NMDA電流。CFA組大鼠與NS組大鼠ACC區(qū)神經(jīng)元NMDA電流的幅度相比明顯減�。–FA組372.6±26.72pAvs對照組258.6±40.38pA，P<0.05，n=5），如圖4所示。
【參考文獻】

相關碩士學位論文 前2條

1 代潔瓊;電針激活大鼠前扣帶皮層κ-阿片受體緩解痛情緒的研究[D];山西醫(yī)科大學;2018年

2 賈欣;激活前扣帶皮層κ-阿片受體對緩解大鼠痛情緒作用的研究[D];山西醫(yī)科大學;2018年

本文編號：2877964