目的:建立基于臨床腫瘤標(biāo)本的胃癌轉(zhuǎn)移模型,分析其轉(zhuǎn)移特征,初步篩選胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并分析其功能,為胃癌的轉(zhuǎn)移研究提供個(gè)體化的臨床前動(dòng)物模型。方法:將臨床新鮮的胃癌手術(shù)標(biāo)本移植到BALB/c裸鼠皮下建立胃癌異種移植(Patient-derived xenograft,PDX)模型,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)情況并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線,連續(xù)傳代維持腫瘤生長(zhǎng)。進(jìn)一步將皮下腫瘤組織通過手術(shù)原位植入到裸鼠胃部肌層建立胃癌原位異種移植(Patient-derived orthotopic xenograft,PDOX)模型,持續(xù)觀察小鼠的生命體征。通過近紅外熒光活體成像技術(shù)檢測(cè)胃部成瘤及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的發(fā)生。待小鼠消瘦后,解剖荷瘤鼠,將肺轉(zhuǎn)移灶和肝轉(zhuǎn)移灶分別移植到裸鼠皮下形成實(shí)體瘤,監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)。收集原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)和STR(Short tandem repeat)分型檢測(cè),確認(rèn)其與患者原發(fā)瘤組織形態(tài)和遺傳的一致性。PCR Array初步分析原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤中胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)。RT-PCR和Western Blot檢測(cè)胃癌傳代細(xì)胞系中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)。依據(jù)分析結(jié)果,選擇MMP2基因進(jìn)一步研究,通過siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默MMP2表達(dá),評(píng)價(jià)MMP2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果:成功建立了人胃癌PDX移植模型,確認(rèn)了移植瘤與患者腫瘤組織病理學(xué)特征的一致性,通過胃部原位移植發(fā)現(xiàn)編號(hào)C19751、C65175和B97493的小鼠發(fā)生肺和肝的轉(zhuǎn)移。其中肺轉(zhuǎn)移灶經(jīng)皮下移植后形成了實(shí)體瘤,STR分析顯示肺轉(zhuǎn)移瘤保持了與原發(fā)瘤相似的遺傳特征。PCR Array和RT-PCR結(jié)果顯示,與原發(fā)瘤相比,MMP2基因在C19751和B97493轉(zhuǎn)移瘤樣本中表達(dá)均顯著上調(diào)。RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,與正常胃上皮細(xì)胞GES-1相比,胃癌細(xì)胞C61262和MKN1中MMP2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高,SGC-7901和BGC-823細(xì)胞中EPHB2和FXYD5 mRNA表達(dá)顯著升高。沉默胃癌細(xì)胞MKN1和C61262中的MMP2基因后,顯著降低了細(xì)胞的遷移能力。結(jié)論:利用胃癌臨床手術(shù)標(biāo)本成功構(gòu)建了3例胃癌轉(zhuǎn)移模型,均保持了原發(fā)腫瘤的生物學(xué)特征,為胃癌的轉(zhuǎn)移研究提供了良好的個(gè)體化實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�。進(jìn)一步篩選出胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP2及備選基因FXYD5和EPHB2,當(dāng)沉默MMP2基因時(shí)可顯著降低胃癌細(xì)胞的遷移能力。
【學(xué)位單位】：延安大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R735.2
【部分圖文】：

基于腫瘤標(biāo)本異種移植模型的胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因研究-13-例胃癌轉(zhuǎn)移模型（編號(hào)為：C19751、C65175和B97493）。首代胃癌轉(zhuǎn)移模型的建立時(shí)間大約在2~4個(gè)月，并且可在裸鼠皮下穩(wěn)定傳代擴(kuò)增維持腫瘤生長(zhǎng)，總體建模成功率約為20%。根據(jù)胃癌PDX模型腫瘤生長(zhǎng)情況，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤體積，繪制出編號(hào)為C19751的移植瘤生長(zhǎng)曲線，記為C19751-Con。將肺和肝轉(zhuǎn)移灶移植到裸鼠背部皮下，結(jié)果只有肺轉(zhuǎn)移灶形成明顯的實(shí)體瘤，同時(shí)繪制出肺轉(zhuǎn)移瘤皮下移植生長(zhǎng)曲線，記為C19751-Met，結(jié)果見圖2-1。生長(zhǎng)曲線顯示，腫瘤呈指數(shù)生長(zhǎng)趨勢(shì)，符合腫瘤生長(zhǎng)特點(diǎn)。轉(zhuǎn)移瘤與原發(fā)瘤比，增殖特性無顯著性差異。將3例配對(duì)標(biāo)本的腫瘤組織進(jìn)行H&E染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2-2。腫瘤組織腺體豐富，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞異型性明顯，且處于增值旺盛階段，符合胃腺癌的病理學(xué)特征。小鼠皮下移植瘤、小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤和原始患者腫瘤基本保持相似的組織病理結(jié)構(gòu)。圖2-1胃癌PDX模型生長(zhǎng)曲線Fig.2-1GrowthcurvesofgastriccancerPDXmodel注：C19751（原發(fā)瘤/轉(zhuǎn)移瘤）生長(zhǎng)曲線（Con為原發(fā)瘤，Met為肺轉(zhuǎn)移瘤）Note:GrowthcurvesoftheC19751gastriccancer(Conrepresentsprimarytumor,Metrepresentsmetastatictumor)

第二章移植臨床腫瘤標(biāo)本建立胃癌轉(zhuǎn)移模型-14-圖2-2胃癌PDX模型的組織學(xué)特征（H&E染色，×400）Fig.2-2HistologiccharacteristicsofgastriccancerPDXmodels(H&Estaining,×400)注：A.原始患者組織；B.小鼠皮下移植瘤；C.小鼠肺轉(zhuǎn)移瘤。Note:A.Primarypatienttumor;B.Mousexenografttumor;C.Mouselungmetastasistumor.2.3.2腫瘤組織溯源性STR分型檢測(cè)按照試劑盒提供的方法，提取三種胃癌PDX模型（C19715、C65175、B97493）原發(fā)瘤及其轉(zhuǎn)移模型腫瘤組織的DNA，進(jìn)行STR分型檢測(cè)，結(jié)果顯示原發(fā)瘤和肺轉(zhuǎn)移瘤同源性為99.99%（圖2-3），證明異種移植瘤來源于原始患者腫瘤。

基于腫瘤標(biāo)本異種移植模型的胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因研究-15-圖2-3胃癌PDX模型STR檢測(cè)Fig.2-3STRdetectionofgastriccancerPDXmodels注：A.C19751原發(fā)瘤/轉(zhuǎn)移瘤；B.C65175原發(fā)瘤/轉(zhuǎn)移瘤；C.B97493原發(fā)瘤/轉(zhuǎn)移瘤。Note:A.C19751primarytumor/metastatictumor;B.C65175primarytumor/metastatictumor;C.B97493primarytumor/metastatictumor.2.3.3胃癌轉(zhuǎn)移模型的特征裸鼠原位移植腫瘤組織4周后，部分小鼠明顯消瘦，注射腫瘤靶向性近紅外熒光染料MHI-148，通過近紅外熒光活體成像發(fā)現(xiàn)，熒光信號(hào)特異性聚集在腫瘤部位；并在小鼠肺部和肝臟出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)（圖2-4A）。小鼠安樂死后，將其解剖，肉眼可見部分小鼠的肺部出現(xiàn)明顯的結(jié)節(jié)狀腫瘤轉(zhuǎn)移灶、部分小鼠的肝臟有多個(gè)明顯的灰白色粟粒樣腫瘤病灶，如圖2-4B。取部分轉(zhuǎn)移灶H&E染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察到肺部和肝臟組織中有明顯的腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域細(xì)胞核大，深染，異型性大，可見病理性核分裂像（圖2-5）。將肺轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)一步移植到裸鼠背部皮下，大
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2878289