目的:極性生長普遍存在于真核生物形態(tài)發(fā)生的過程中,真菌是極性生長模式研究的理想生物,真菌的極性生長過程及其復(fù)雜。本文首先通過已構(gòu)建的煙曲霉Bem46-eGFP菌株小培養(yǎng)觀察了該基因在煙曲霉孢子及其萌發(fā)狀態(tài)時在激光共聚焦顯微鏡下熒光的分布情況;其次通過實(shí)時熒光定量PCR對比標(biāo)準(zhǔn)株Ku80和Bem46缺陷株中極性生長相關(guān)基因的表達(dá)量,初步探索bem46基因在煙曲霉極性生長過程中可能的機(jī)制。方法:首先分別活化煙曲霉標(biāo)準(zhǔn)株Ku80、△Bem46和Bem46-eGFP菌株(后兩株菌本團(tuán)隊(duì)在前期工作已構(gòu)建完成)。配置Bem46-eGFP菌株孢子混懸液,定量,分別經(jīng)GMM培養(yǎng)基培養(yǎng)0h及7h后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察孢子及其萌發(fā)狀態(tài)下熒光的定位情況。然后分別提取標(biāo)準(zhǔn)株和△Bem46的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA,最后通過實(shí)時熒光定量PCR方法比較極性生長相關(guān)基因gel1、gel2、gel4、crzA、cdc42及rsr1在這兩株菌中的相對表達(dá)量。結(jié)果:通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),Bem46-eGFP菌株在孢子狀態(tài)下熒光聚集在孢子部位,而當(dāng)菌株萌發(fā)至有芽管出現(xiàn)時,熒光聚集在孢子的發(fā)芽及出現(xiàn)芽管的部位;△Bem46菌株中,gel1基因的表達(dá)量約為標(biāo)準(zhǔn)株的0.43倍,gel2基因的表達(dá)量約為標(biāo)準(zhǔn)株的0.18倍,cdc42基因的表達(dá)量約為標(biāo)準(zhǔn)株的0.19倍,crzA基因的表達(dá)量約為標(biāo)準(zhǔn)株的0.30倍,上述基因表達(dá)量均下調(diào);gel4基因的表達(dá)量約為標(biāo)準(zhǔn)株的0.95倍,表達(dá)量無明顯變化;rsr1基因的表達(dá)量約為標(biāo)準(zhǔn)株中3.49倍,表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:bem46基因可能參與煙曲霉孢子的均質(zhì)生長及孢子極性生長位點(diǎn)的選擇,推測其類似于粗糙脈孢菌可能是通過向發(fā)芽及分支部位聚集生長素等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行的,尚待進(jìn)一步驗(yàn)證;煙曲霉bem46基因的缺失導(dǎo)致極性生長相關(guān)基因gel1、gel2、cdc42及crzA的表達(dá)下調(diào),使rsr1基因表達(dá)上調(diào),對gel4基因表達(dá)無明顯影響,推測bem46基因可能是通過參與各目的基因相關(guān)的細(xì)胞壁完整性途徑、鈣-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶途徑、極性位點(diǎn)的選擇等方面來影響目的基因的表達(dá)量,但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R379.6
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文62結(jié)果通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Bem46-eGFP菌株在孢子狀態(tài)下熒光基本均勻分布在孢子部位，（見圖1），而當(dāng)菌株萌發(fā)至有芽管出現(xiàn)時，熒光聚集在孢子萌發(fā)部位及芽管部位（見圖2）。圖1（共聚焦油鏡，×600）：煙曲霉Bem46-eGFP孢子狀態(tài)下熒光的分布，左側(cè)為明場條件下，右側(cè)為熒光激發(fā)狀態(tài)下，兩圖拍攝為同一視野，可見熒光基本均勻分布在孢子位置。圖2（共聚焦油鏡，×600）：煙曲霉Bem46-eGFP孢子發(fā)芽至芽管出現(xiàn)時熒光的分布，左側(cè)為明場條件下，右側(cè)為熒光激發(fā)狀態(tài)下，兩圖拍攝為同一視野，可見熒光聚集在孢子發(fā)芽及芽管部位。

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文62結(jié)果通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Bem46-eGFP菌株在孢子狀態(tài)下熒光基本均勻分布在孢子部位，（見圖1），而當(dāng)菌株萌發(fā)至有芽管出現(xiàn)時，熒光聚集在孢子萌發(fā)部位及芽管部位（見圖2）。圖1（共聚焦油鏡，×600）：煙曲霉Bem46-eGFP孢子狀態(tài)下熒光的分布，左側(cè)為明場條件下，右側(cè)為熒光激發(fā)狀態(tài)下，兩圖拍攝為同一視野，可見熒光基本均勻分布在孢子位置。圖2（共聚焦油鏡，×600）：煙曲霉Bem46-eGFP孢子發(fā)芽至芽管出現(xiàn)時熒光的分布，左側(cè)為明場條件下，右側(cè)為熒光激發(fā)狀態(tài)下，兩圖拍攝為同一視野，可見熒光聚集在孢子發(fā)芽及芽管部位。

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文14由圖3、5、7、9、11、13可知各目的基因均呈典型的“S”型擴(kuò)增，因本實(shí)驗(yàn)使用的是SYBR方法，可能對于雜質(zhì)或引物二聚體也進(jìn)行非特異性擴(kuò)增，故需對每個目的基因進(jìn)行熔解曲線分析確保沒有引物二聚體等其他雜物，從圖4、6、8、10、12、14可以看出各目的基因均有一單個熔解峰值，說明實(shí)驗(yàn)中未檢測到其他副產(chǎn)物，各目的基因擴(kuò)增良好。圖3gel1基因及內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線圖4gel1基因及內(nèi)參基因的熔解峰圖圖5gel2基因及內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 呂運(yùn)通;王文嶺;;真菌極性生長結(jié)構(gòu)的研究現(xiàn)狀[J];中國真菌學(xué)雜志;2012年02期

本文編號：2875850