發(fā)布時間：2020-11-05 05:19

　　 基因突變是癌癥診斷和監(jiān)視的重要生物標志物,靈敏地識別單核苷酸變異有助于實現(xiàn)精準醫(yī)療。現(xiàn)有的檢測方法包括測序、探針雜交、基于引物延伸的擴增反應、基于酶特異性識別的酶切技術及連接反應等,存在著諸多不足,如需要熱循環(huán)、昂貴的儀器、精確的溫度控制、專業(yè)的技術人員、靈敏度和特異性不足等等。針對上述問題,本論文以阻斷劑置換放大擴增系統(tǒng)(BDA)和超支化滾環(huán)擴增(HRCA)技術為基礎,創(chuàng)新性地提出了一種新的靈敏、簡便、廉價和高特異性的單核苷酸變異等溫擴增和檢測方法,主要研究內容如下:首先提出檢測原理并實驗驗證該方法的可行性,針對引物2和dNTP濃度進行條件優(yōu)化,并通過實驗測定了該方法檢測DNA單堿基變異的性能。結果表明,在突變型和野生型基因中加入同野生型完全匹配的阻斷劑后,鎖式探針3'端可以與阻斷劑進行合理的競爭雜交,從而導致大量的鎖式探針與突變型靶標雜交并延伸,以“間隙—填充”形式連接成環(huán),而只有少量的野生型對應的鎖式探針可以成環(huán);然后在引物1的作用下擴增出一條長的ssDNA產物,引物2與阻斷劑在這條長鏈上繼續(xù)競爭雜交,最終實現(xiàn)選擇性等溫擴增突變型靶標,可以檢測到等位基因頻率為0.1%的已知或未知單核苷酸變異。該方法從原理上克服了常規(guī)熱力學檢測單堿基差異核酸時的溫度敏感性,解決了PCR需要熱循環(huán)和專業(yè)技術人員、昂貴的缺點,為低豐度未知或已知單堿基變異的檢測提供了新的方向。其次實驗證明該方法可以應用于集群癌癥突變的擴增,并且能夠檢測到細胞中提取的基因組DNA中的0.1%的KRAS單堿基變異,實驗結果通過桑格測序得到完美驗證。對促進體外診斷和精確臨床治療的發(fā)展具有重要意義,為資源匱乏地區(qū)的護理點診斷提供了新的依據。最后提出原位檢測細胞KRAS突變表達的mRNA原理及方法,設計了dsDNA的直接檢測,并初步取得mRNA原位成像效果,為細胞原為檢測提供了新思路。由于局部環(huán)境不同、細胞異質性和遷移,該方法提供單分子水平的靈敏度以及超高特異性,預計將促進利用mRNA突變作為生物標志物進行診斷的相關生物醫(yī)學研究的發(fā)展。
【學位單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R440
【部分圖文】：

華東師范大學碩士學位論文第一章2據估計，2018年全球癌癥發(fā)病率和死亡率中，肺癌作為最常見的癌癥，占總病例的11.6%，是癌癥死亡的主要原因（占癌癥死亡總數的18.4%），其次是女性乳腺癌（11.6%）、前列腺癌（7.1%）、結直腸癌（6.1%）、大腸癌（9.2%）、胃癌（8.2%）和肝癌（8.2%）[63]。據中國疾控中心（CDC）估計，在我國多項疾病致死原因中，癌癥高居第二位，只低于心血管疾病，并且每年有三百多萬的新生癌癥病例和二百多萬死亡病例。而造成癌癥的大部分原因是各種物理、化學等外界因素和遺傳、生活習慣等內在因素的長期影響，導致人體細胞中的基因受到損傷或發(fā)生改變，也就是常說的基因突變。圖1.12015年70歲以下癌癥死因分布的全球地圖[63]根據世衛(wèi)組織（WHO）的建議，癌癥的發(fā)現(xiàn)時間很大程度上會影響癌癥的治療效果和生存率，如果能夠實現(xiàn)癌癥的早期診斷，估計可有效延長1/3患者的生命，并且能夠完全治愈1/3的患者。因此早診斷早治療就成為提高癌癥治愈率的關鍵。

華東師范大學碩士學位論文第一章5行比色測定。雖然AS-PCR技術在選擇性擴增和靶序列檢測方面有出色的表現(xiàn)，但是其有限的復用能力、引物二聚體的形成和昂貴的熱循環(huán)儀限制了其發(fā)展。圖1.2通過硫醇標記的引物引發(fā)等位基因特異性PCR的SNP分型示意圖[15]單堿基延伸（SBE）Goelet等人于1999年提出了單堿基延伸法，他們將引物的3"端設計在DNA模板的SNV位點上，并引入四種雙脫氧核苷酸（ddATP、ddTTP、ddGTP和ddCTP），在DNA聚合酶的作用下，引物3"端延伸出與目標SNV互補的單個雙脫氧核苷酸（ddNTP）。因為雙脫氧核苷酸缺乏鏈延伸所必需的3"端羥基基團，一旦將雙脫氧核苷酸添加到引物中就不會發(fā)生進一步的鏈延長[16,17]。通過不同的檢測技術，如熒光法[18]、MALDI-TOF質譜[19]、凝膠電泳[20]等來確定摻入核苷酸的種類來鑒別SNV。例如，Xu等人[18]開發(fā)了一種基于GO對熒光素標記的dGTP（dGTP-F1）和雙鏈DNA（dsDNA）的單堿基延伸反應的不同吸收能力的新型熒光SNP檢測方法（圖1.3）。dGTP-F1通過延伸反應摻入到突變型目標匹配的探針中，由于dsDNA和GO之間的相互作用較弱，導致突變型目標恢復了熒光；而由于野生型和探針不匹配，不能進行延伸，GO對dGTP-F1的熒光有淬滅作用而使野生型目標的熒光減弱。其檢測線性范圍為3nM-50nM，在野生型的存在下可以檢測到低至10％的突變型目標。

華東師范大學碩士學位論文第一章6圖1.3氧化石墨烯（GO）-SNP傳感原理圖[18]1.2.2.2基于探針雜交的檢測技術DNA雜交探針提供了檢測互補核酸靶標的簡單方法，通過使用嚴格的Watson-Crick堿基配對規(guī)則提高檢測速度和準確性。但因為SNV與野生型對應物之間的熱力學差異僅為幾千卡/摩爾，除了在DNA的解鏈溫度Tm附近，完美互補的結合在能量上比錯配鏈的結合更有利，在其他溫度下傳統(tǒng)的雜交探針的靶結合活性可能是非特異性的[21]。盡管可以通過雜交或在隨后的雜交Tm附近的洗滌步驟獲得單堿基特異性[22]，該方法的實際實施仍然涉及三個主要挑戰(zhàn)。首先，需要大量的投資用于多次實驗驗證和條件優(yōu)化，因為需要為每個新的待測物尋找最佳溫度；其次，這種方法的復用能力有限，并且當必須在相同條件下同時分析各自具有不同的Tm的多個目標時，這些方法可能無效；最后，即使在優(yōu)化的反應條件下，雜交親和力中位數差異也只在5到26之間[23-26]。為了克服這些限制，已經進行了許多嘗試來設計雜交探針，使雜交探針在更寬的溫度范圍內具有改善的結合特性和對單堿基錯配的更高特異性。這些增強的雜交探針是通過縮短探針的序列長度、化學修飾探針或對探針施加約束（如發(fā)夾探針）來開發(fā)的。短雜交探針通過減小雜交探針的長度，可以顯著提高依賴于完美匹配和不匹配鏈之間差異雜交的SNV鑒別方法的選擇性。這是因為在堿基對較少的雙鏈體中，單堿基錯配的去穩(wěn)定作用更為明顯，這使得探針與錯配序列的結合在熱力學上不利
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本文編號：2871186