發(fā)布時間：2020-11-04 22:04

　　 DNA甲基化譜式的異常可以作為腫瘤診斷、治療和預后的標志之一。通過抑制DNA甲基轉移酶(DNMT)活性,逆轉腫瘤細胞中DNA甲基化譜式的異常和促進相關抑癌基因的重新表達,是一種重要的癌癥治療方法。UHRF1是維持性DNA甲基轉移酶DNMT1的重要輔助因子,它通過其特異的SRA結構域結合DNA復制過程中產(chǎn)生的半甲基化DNA并介導DNMT1的招募和維持性DNA甲基化。UHRF1在多種腫瘤細胞中高表達,并且可以作為腫瘤治療的潛在靶點。我們設計了能夠抑制UHRF1蛋白的SRA結構域結合半甲基化DNA的小分子化合物,并通過體外和細胞內實驗檢測其效果。為了尋找靶向UHRF1的SRA結構域的小分子化合物,陽懷宇教授實驗室首先通過計算化學的虛擬篩選方法獲得了116個潛在的結合SRA結構域的小分子化合物。利用EMSA實驗,我們從116個小分子化合物中篩選出6個能夠在體外抑制UHRF1結合半甲基化DNA的化合物。通過HPLC方法檢測細胞整體的DNA甲基化水平,我們發(fā)現(xiàn)42號和68號化合物能夠在細胞實驗中下調整體的DNA甲基化水平。后續(xù)我們通過CCK8試劑盒檢測細胞增殖情況、Western Blot檢測UHRF1和DNMT1蛋白水平、qRT-PCR檢測干擾素信號通路基因的表達情況,我們發(fā)現(xiàn)42/68號化合物能夠抑制細胞增殖、但不影響UHRF1的轉錄及蛋白水平、也不會促進干擾素信號通路基因的表達。此外,聯(lián)合使用42/68號化合物與DNMTs家族抑制劑雖然不能更大幅度地下調細胞的整體DNA甲基化水平,但可以更好地抑制腫瘤細胞生長。綜上,我們的實驗發(fā)現(xiàn)了兩個靶向UHRF1的SRA結構域的小分子化合物,該化合物可以作為UHRF1-SRA的潛在小分子抑制劑。
【學位單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R965.1
【部分圖文】：

華東師范大學碩士學位論文2在惡性增殖的細胞系中測試表型反應，檢測小分子化合物對細胞增殖、細胞凋亡或細胞周期的影響。在檢測這些表型變化的同時，還要通過分子生物學等方法尋找潛在的分子機制；3）隨后在動物體內測試這些在體外篩選到的具有潛力的小分子化合物，檢測在腫瘤動物模型中是否可以提供生存方面的治療益處。在動物研究過程中，也要提供關于藥物毒性和藥代動力學特性等信息；4）根據(jù)這些臨床前的研究結果，潛在的候選分子才可被帶入臨床環(huán)境；5）當新藥在臨床試驗中證明是有益的時侯，才會被FDA等監(jiān)管機構批準用于常規(guī)臨床治療3。圖1.1部分表觀遺傳藥物開發(fā)的過程及當前狀態(tài)31.2腫瘤細胞和正常細胞的表觀遺傳修飾差異基因正常有序的轉錄是機體細胞行使正常功能的前提，如果基因轉錄調控功能失調，細胞就可能發(fā)生癌變。DNA甲基化、組蛋白修飾等是表觀遺傳調控機制的重要組成部分。與正常細胞相比，腫瘤細胞內的表觀遺傳修飾發(fā)生了明顯的改變。腫瘤細胞內DNA甲基化譜式發(fā)生改變。與正常細胞相比，腫瘤細胞基因組

華東師范大學碩士學位論文3中的轉座子、重復序列區(qū)域的DNA甲基化水平明顯下降，導致基因組整體DNA甲基化水平的下降。這會促進原先沉默的轉座子發(fā)生轉錄，導致基因組序列重排、基因組的不穩(wěn)定及細胞增殖異常等。相反，腫瘤細胞中抑癌基因的啟動子區(qū)域DNA甲基化水平明顯升高，這會導致抑癌基因沉默，促進癌癥的發(fā)生發(fā)展10-12。很多研究表明，腫瘤細胞的DNA甲基化譜式可以用作定義腫瘤類型、臨床治療和預后的標志13,14。對多種腫瘤細胞的基因組進行測序發(fā)現(xiàn)，原先正常未甲基化的啟動子CpG島中有5％-10％的啟動子會發(fā)生異常高甲基化，而且啟動子處的CpG島發(fā)生超甲基化后，不僅會影響蛋白質編碼基因的表達，還會影響各種非編碼RNA的表達，其中一些非編碼RNA還參與了細胞的惡性轉化15-18。DNA甲基化與組蛋白修飾之間總是相互影響的。在正常細胞的低DNA甲基化水平的區(qū)域，組蛋白H3、H4上的修飾主要以乙�；癁橹鳎℉3/H4Ac、H3K4me2/3），而在轉座子、重復序列等高甲基化水平的區(qū)域，組蛋白H3、H4上的修飾以甲基化為主（H3K27me3、H3K9me3、H4K20me3）。當正常細胞轉變?yōu)槟[瘤細胞后，除了上面說到的DNA甲基化譜式發(fā)生改變外，組蛋白的修飾也隨著DNA甲基化修飾的改變而改變19。圖1.2表觀遺傳修飾在正常/癌癥細胞中的變化19

華東師范大學碩士學位論文171.6靶向UHRF1的治療到目前為止，所有測試過的天然抗癌化合物都涉及抑癌基因的上調表達，同時還下調了UHRF1的表達123-125。尋找一種可以抑制腫瘤細胞增殖而又不妨礙UHRF1在非癌細胞中發(fā)揮其基因組穩(wěn)定性作用的特異性抑制劑將是很有意義的。圖1.6本圖介紹了可能利用UHRF1產(chǎn)品或干擾UHRF1相關途徑的分子靶向療法111。（A）UHRF1通路，促進癌癥進展和弓形蟲增殖，以及通過蛋白酶體降解蛋白質的一般過程。（B）利用干擾UHRF1相關途徑的可能療法。使用合成的UHRF1肽的UHRF1癌癥疫苗可用于癌癥治療。UHRF1靶向治療還包括UHRF1-siRNA，小分子化合物和可滲透的顯性負肽抗體療法不適合UHRF1的分子靶向治療，原因在于能夠用于抗體治療的靶向蛋白應該是存在于體液內或者細胞膜上的能夠被抗體識別的蛋白，而UHRF1在細胞質中合成，在細胞核中發(fā)揮作用，所以不能使用抗體療法。UHRF1-siRNA也不適合用于癌癥患者的治療。雖然針對UHRF1的siRNA能夠抑制細胞生長，但是siRNA在血液中容易被血清核酸酶降解，并且它分子量小，呈負電荷，不易被腎小球重吸收而排入尿液。另外如何將siRNA準確輸送到目標位置也是另一個重要研究領域。
【參考文獻】

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3 王澳軒;劉冰妮;劉穎;劉登科;劉默;儲德清;;抑制JAK3激酶的免疫抑制劑托法替尼[J];藥物評價研究;2014年02期

相關博士學位論文 前1條

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本文編號：2870670