目的:研究砷氟聯(lián)合染毒對H9c2心肌細(xì)胞毒性作用;探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)和細(xì)胞凋亡在砷氟聯(lián)合染毒對H9c2心肌細(xì)胞損傷中的關(guān)系及作用;分析砷氟聯(lián)合染毒時(shí)兩者之間的相互作用關(guān)系。方法:本實(shí)驗(yàn)采用H9c2心肌細(xì)胞模型,砷氟單獨(dú)及聯(lián)合染毒按不同劑量分為9組:對照組(C組),低砷組(As_(10)組,10μM),高砷組(As_(25)組,25μM),低氟組(F_(10)組,10 mg/L),高氟組(F_(35)組,35mg/L),低砷低氟組[As_(10)F_(10)組,10μM(As)+10 mg/L(F)],低砷高氟組[As_(10)F_(35)組,10μM(As)+35mg/L(F)],高砷低氟組[As_(25)F_(10)組,25μM(As)+10 mg/L(F)],高砷高氟組[As_(25)F_(35)組,25μM(As)+35mg/L(F)]。通過CCK-8法檢測砷氟聯(lián)合染毒后的H9c2心肌細(xì)胞存活率;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率;使用倒置顯微鏡、光鏡和電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的改變;檢測心肌酶AST和CRE的酶活力;通過qRT-PCR法檢測心肌細(xì)胞中ERS相關(guān)基因GRP78、PERK和CHOP的表達(dá)情況;通過Western-blot法檢測心肌細(xì)胞中ERS和凋亡相關(guān)蛋白GRP78、PERK、CHOP和Cleaved-caspase-3的表達(dá)情況;采用免疫熒光法檢測心肌細(xì)胞中ERS標(biāo)志基因GRP78的表達(dá)情況。進(jìn)一步,我們采用ERS抑制劑4-PBA干預(yù)后,檢測心肌細(xì)胞存活率和ERS相關(guān)基因GRP78和CHOP的蛋白表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS22.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和析因分析。結(jié)果:1、存活率和凋亡率的改變:(1)存活率結(jié)果顯示,不同劑量砷氟染毒12h和24h時(shí),細(xì)胞存活率呈上升趨勢,并達(dá)到最高;48h、72h和96h后,隨著時(shí)間的延長,細(xì)胞存活率呈時(shí)間依賴性下降。且染毒24h時(shí)各染毒組中存活率比對照組均顯著的降低(除As_(10)組和As_(10)F_(10)組外)。(2)凋亡率結(jié)果顯示,各染毒組早凋率和總凋率比對照組均顯著上升。2、心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變:(1)鏡下觀察:單砷組細(xì)胞體積收縮,排列紊亂,密度減小;F_(35)組細(xì)胞排列整齊,存在少量變圓的凋亡細(xì)胞;聯(lián)合染毒組細(xì)胞相互交聯(lián),密度減少,變圓的凋亡細(xì)胞明顯增加。(2)HE染色:單砷組細(xì)胞數(shù)量變少,輪廓模糊,核內(nèi)染色質(zhì)凝集,壞死細(xì)胞數(shù)目較多;F_(35)組部分細(xì)胞腫大,輪廓模糊,F_(10)組無明顯改變;聯(lián)合染毒組的細(xì)胞有不同程度的腫大,間隙變寬,核內(nèi)染色質(zhì)凝集,其中As_(25)F_(10)組和As_(25)F_(35)組部分細(xì)胞核膜完整性受損,染色質(zhì)凝集。3、心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變:(1)細(xì)胞核:F_(10)組的細(xì)胞核無明顯改變,其余各染毒組的細(xì)胞核表面有深淺不一的凹陷,核內(nèi)染色質(zhì)不同程度的散落在細(xì)胞邊緣。As_(25)組和F_(35)組以及As_(25)F_(35)聯(lián)合組的細(xì)胞核體積明顯縮小。(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng):單砷組細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹最嚴(yán)重,擴(kuò)張呈池狀;單氟組細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張腫脹的數(shù)量明顯增多且呈泡狀;聯(lián)合組的細(xì)胞表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒,核蛋白體脫落、游離,擴(kuò)張呈泡狀或池狀的數(shù)量明顯增多。4、心肌損傷標(biāo)志物的改變:與對照組相比,砷氟單獨(dú)染毒組AST和CRE活力顯著性增加(除F_(10)組的CRE);砷氟聯(lián)合染毒組中僅在As_(10)F_(35)組和As_(25)F_(35)組CRE活力顯著性增加,但AST活力無顯著變化。5、ERS與凋亡相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)情況:(1)mRNA表達(dá):在各染毒組中,CHOP mRNA的表達(dá)水平均顯著性升高。GRP78 mRNA的表達(dá)水平在As_(10)F_(35)組和As_(25)F_(10)組中顯著性升高。PERK的mRNA的表達(dá)水平在As_(10)F_(35)組、As_(25)F_(10)組和As_(25)F_(35)組中顯著性升高。GRP78和PERK的mRNA表達(dá)水平在其余染毒組雖然表現(xiàn)出上升趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2)蛋白表達(dá):在各染毒組中,GRP78、PERK和CHOP的蛋白表達(dá)水平均顯著性升高,但As_(25)組的PERK和As_(25)F_(35)組的CHOP無顯著差異。Cleaved-casapse3的蛋白表達(dá)水平在單砷組無明顯變化,而在單氟組顯著升高,砷氟聯(lián)合組僅在As_(10)F_(10)組和As_(10)F_(35)組中顯著性升高。(3)免疫熒光ERS標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá):GRP78的平均熒光強(qiáng)度僅在As_(25)組、F_(35)組、As_(25)F_(10)組和As_(10)F_(35)組中顯著性增強(qiáng)。6、抑制劑4-PBA干預(yù)砷氟染毒后,細(xì)胞存活率以及ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)情況:(1)存活率:與各染毒組相比,抑制劑4-PBA干預(yù)后,各染毒組細(xì)胞存活率顯著升高(除As_(10)組和As_(10)F_(35)組外)。(2)ERS相關(guān)蛋白的表達(dá):與染毒組相比,抑制劑4-PBA干預(yù)后,GRP78的蛋白表達(dá)量均顯著下降(除F_(35)組、As_(10)F_(35)組和As_(25)F_(35)組外),而CHOP蛋白表達(dá)量均下降,但僅在F_(10)組和As_(25)F_(10)組中顯著下降。7、交互作用分析結(jié)果顯示,砷氟聯(lián)合染毒對凋亡率的影響中,As_(25)F_(10)組和As_(25)F_(35)組中砷與氟存在協(xié)同效應(yīng),As_(10)F_(10)組和As_(10)F_(35)組中砷與氟存在拮抗效應(yīng)。除此之外,砷氟聯(lián)合染毒對心肌酶(AST和CRE)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)mRNA(GRP78和PERK)和蛋白(GRP78、PERK和CHOP)以及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-casapse3的影響中,砷和氟之間主要表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。結(jié)論:1、砷氟聯(lián)合染毒抑制了H9c2心肌細(xì)胞的存活率,改變了心肌細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)(細(xì)胞核和ER),激活了心肌損傷相關(guān)酶活力,并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生早期凋亡,最終導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞損傷。2、砷氟聯(lián)合染毒后,首先激活了GRP78與PERK表達(dá)水平,然后啟動(dòng)了ERS早期凋亡因子CHOP,進(jìn)一步引起了Caspase-3的激活,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此,我們分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路可能參與了砷氟聯(lián)合染毒致心肌細(xì)胞損傷的過程。3、析因分析結(jié)果顯示,砷氟聯(lián)合染毒在對心肌損傷、ERS和凋亡影響的過程中,各個(gè)指標(biāo)在砷與氟之間主要表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文6基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.2.3細(xì)胞存活率的測定本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8檢測細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)方法如下圖所示：圖1-1細(xì)胞存活率測定方法流程圖1.2.4心肌細(xì)胞凋亡的測定將細(xì)胞懸液以100萬個(gè)/瓶的密度接種于T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24h后。按表1-1分組染毒24h。用不含有EDTA的胰酶消化、吹打，1000r/min離心10min；倒掉上清，PBS洗滌細(xì)胞沉淀3次，制成體積為2ml的細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞于試管中，在試管中加入500μL的BindingBuffer懸浮細(xì)胞，在1500r/min下離心5分鐘；棄上清液，加入5μL的AnnexinV混勻，再加入5μL的PropidiumIodide混勻后。室溫下避光反應(yīng)20分鐘，最后加上250μL的上機(jī)液進(jìn)行檢測。1.2.5鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)的變化按表1-1分組染毒24h，觀察鏡下細(xì)胞形態(tài)并拍照。1.2.6觀察細(xì)胞形態(tài)的病理變化在24孔板里滴一滴完全培養(yǎng)基，然后把專用蓋玻片（D=14mm的圓形爬片）放在24孔板里。將細(xì)胞懸液以2萬個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種。按表1-1分組染毒24h，采用HE染色法觀察細(xì)胞形態(tài)的病理變化，按本課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法操作[50]。1.2.7觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)使用電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)方法如下圖所示：

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文7圖1-2電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)流程圖1.2.8試劑盒檢測細(xì)胞AST和CRE活力將細(xì)胞懸液以100萬個(gè)/瓶的細(xì)胞密度接種24h后。按表1-1分組染毒24h→倒掉原來培養(yǎng)液，PBS洗滌→消化、吹打，離心→倒掉上清，PBS洗滌細(xì)胞沉淀→制成體積為500μl的細(xì)胞懸液→以100HZ，5s/次，共8次對細(xì)胞懸液進(jìn)行超聲破碎→破碎后的細(xì)胞懸液根據(jù)谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和肌酐（CRE）試劑盒說明書的方法步驟進(jìn)行，在510nm和546nm的波長下測定吸光度值。1.2.9統(tǒng)計(jì)方法本實(shí)驗(yàn)通過SPSS22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有結(jié)果以x±s表示。以P<0.05作為判斷差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文82結(jié)果2.1砷氟聯(lián)合染毒對心肌細(xì)胞存活率的影響本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)和查閱大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，選擇砷（0，10，25，30，35，40，45和50μM）和氟（0，5，10，20，30，35，40和50mg/L）做預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行砷、氟濃度選擇。如圖1-3所示，與對照組相比，當(dāng)砷濃度為25μmol/L和氟濃度為35mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率開始顯著性降低（P<0.05），其存活率分別為87.0%和84.1%；隨著砷、氟濃度的增加，細(xì)胞存活率呈劑量依賴性下降�？紤]到砷氟聯(lián)合染毒可能會(huì)進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖，因此本實(shí)驗(yàn)后續(xù)選定的砷濃度為0μM、10μM和25μM，氟濃度為0mg/L，10mg/L和35mg/L，由此組成9個(gè)不同劑量的砷氟單獨(dú)及聯(lián)合染毒組。如圖1-4A所示，不同劑量砷氟染毒12h和24h時(shí)，細(xì)胞存活率呈上升趨勢，并達(dá)到最高；48h、72h和96h后，隨著時(shí)間的延長，細(xì)胞存活率呈時(shí)間依賴性下降。除As10組和As10F10組外，各染毒組H9c2心肌細(xì)胞存活率較對照組均顯著性下降（P<0.05）。砷、氟單獨(dú)組中，As25組和F35組的細(xì)胞存活率最低，分別為86.0%和86.7%。砷氟聯(lián)合組中，A25F35聯(lián)合組的細(xì)胞存活率最低，存活率為77.7%（見圖1-4B）。注：與對照組比較*：P<0.05，**：P<0.01圖1-3砷、氟單獨(dú)染毒對H9c2心肌細(xì)胞存活率的影響
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本文編號：2870617