【摘要】：隨著現(xiàn)代化工業(yè)的不斷發(fā)展,鎘暴露到空氣、土壤等越來(lái)越多,造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。鎘通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體,其在體內(nèi)清除時(shí)間長(zhǎng)達(dá)40年。鎘暴露會(huì)對(duì)肝、腎、肺等多種器官造成毒性損傷,引發(fā)多種疾病,如高血壓、高血脂等。重金屬會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生毒副作用,但對(duì)于脾臟的毒性研究較少。因此本研究探討鎘暴露誘導(dǎo)小鼠脾臟及人B淋巴細(xì)胞系Ramos細(xì)胞中自噬的產(chǎn)生以及鎘毒性的機(jī)理。本研究中,以小鼠和Ramos細(xì)胞為模型。通過(guò)連續(xù)喂養(yǎng)一周含鎘飼料對(duì)小鼠進(jìn)行鎘暴露,建立小鼠鎘中毒模型;采用0-5μM的鎘處理Ramos細(xì)胞24 h,建立細(xì)胞模型,通過(guò)Western blot確定小鼠和Ramos細(xì)胞中自噬生物標(biāo)識(shí)蛋白LC3-II增加,而P62的蛋白水平下降,并呈劑量依賴(lài)性。鎘暴露致使細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng),表明鎘誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)酸性小體增多,以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明鎘可以促進(jìn)脾臟組織及Ramos細(xì)胞的自噬過(guò)程。前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VMP1蛋白在鎘暴露的小鼠脾臟和Ramos細(xì)胞中累積,VMP1是一種含有6個(gè)疏水結(jié)構(gòu)的穿膜蛋白,在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)其與自噬有關(guān)。本研究利用RNA干擾技術(shù)檢驗(yàn)VMP1在鎘誘導(dǎo)自噬中的作用,利用siRNA抑制Ramos細(xì)胞中VMP1的表達(dá),進(jìn)而抑制鎘暴露誘導(dǎo)的LC3-II上升,說(shuō)明鎘誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞自噬依賴(lài)于VMP1。利用放線菌酮CHX抑制蛋白質(zhì)的合成,檢測(cè)Ramos細(xì)胞中VMP1蛋白的降解,鎘暴露細(xì)胞CHX處理后,VMP1的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng),這可能是鎘暴露誘導(dǎo)細(xì)胞中VMP1蛋白上升的主要原因。據(jù)報(bào)道活性氧(ROS)是誘發(fā)自噬的主要原因之一,本研究發(fā)現(xiàn)鎘可以誘導(dǎo)細(xì)胞中ROS和鈣離子上調(diào),用ROS的清除劑生育酚TCP處理Ramos細(xì)胞后,鎘誘導(dǎo)的ROS和鈣離子上調(diào)受到抑制,同時(shí)鎘誘導(dǎo)的自噬也被抑制。用鈣離子通道IP3受體抑制劑2-氨基乙基二苯硼酸酯2-APB預(yù)處理Ramos細(xì)胞后,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ROS沒(méi)有顯著變化,然而細(xì)胞質(zhì)中鈣離子的上調(diào)受到抑制,鎘誘導(dǎo)的VMP1和LC3-II上升也受到抑制。這些結(jié)果表明鎘產(chǎn)生的ROS對(duì)自噬的誘導(dǎo)依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)鈣離子的上調(diào)和VMP1蛋白的增加,并且在鎘激活自噬的信號(hào)通路中,鈣離子和VMP1蛋白是ROS的下游。采用流式細(xì)胞儀和Western blot研究鎘暴露的Ramos細(xì)胞發(fā)現(xiàn)鎘存在時(shí)Aninxin V陽(yáng)性細(xì)胞增多并且凋亡標(biāo)識(shí)蛋白表達(dá)PARP、Caspase3上升。自噬抑制劑CQ能夠減緩鎘誘導(dǎo)凋亡蛋白PARP、Caspase3的表達(dá),阻止Aninxin V陽(yáng)性細(xì)胞增多。并且抑制鎘導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂釋放乳酸脫氫酶(LDH)。這些結(jié)果說(shuō)明鎘在Ramos細(xì)胞中誘導(dǎo)的自噬可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R114

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2573763