【摘要】：研究背景血管生成是新生血管形成的基礎(chǔ),近年來,有大量的研究表明,血管生成在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。因此,抗腫瘤血管生成研究是抗腫瘤治療領(lǐng)域中極有前景的一個(gè)重要方向。但是近年來,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多個(gè)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的血管生成抑制劑,特別是針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的單抗類藥物,在臨床前或臨床水平上表現(xiàn)出嚴(yán)重毒副作用。因此,尋找新靶點(diǎn)或新藥物分子對(duì)于抗腫瘤血管生成新策略的開發(fā)具有重要的意義。既往研究發(fā)現(xiàn)速激肽受體家族的重要成員之一,神經(jīng)激肽-3受體(NK3R),在機(jī)體內(nèi)多種生理過程中起到重要作用,但對(duì)其在血管生成中的作用和機(jī)制仍然不清楚。已有研究發(fā)現(xiàn),NK3R的高親和配體,內(nèi)源性神經(jīng)激肽B(NKB)可抑制血管生成,這表明靶向抑制NK3R通路可有效阻斷新生血管生成�；谝陨涎芯�,本論文基于NK3R激動(dòng)劑[MePhe7]NKB,通過引入腫瘤靶向序列NGR和CNGRC,分別構(gòu)建了兩種類似物NK3R-A1與NK3R-A2。通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探索NK3R激動(dòng)劑及其類似物的抗血管生成作用和抗腫瘤效應(yīng),通過聯(lián)合應(yīng)用NK3R選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]研究NK3R激動(dòng)劑及其類似物的作用機(jī)制。研究目的本研究的主要目的是對(duì)本論文設(shè)計(jì)的兩種基于NK3R激動(dòng)劑[MePhe7]NKB結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造的NK3R激動(dòng)劑類似物NK3R-A1和NK3R-A2在體內(nèi)和體外分別進(jìn)行抗血管生成作用及其機(jī)制的研究。研究方法基于本實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ),通過大量文獻(xiàn)查閱,本論文從NK3R激動(dòng)劑[MePhe7]NKB出發(fā),通過引入兩類腫瘤靶向序列,構(gòu)建了結(jié)構(gòu)改造的NK3R激動(dòng)劑類似物NK3R-A1和NK3R-A2。通過Fmoc固相合成策略合成了NK3R激動(dòng)劑及其類似物以及NK3R拮抗劑[Gly6]NKB[3-10],以反相高效液相色譜法進(jìn)行純化,經(jīng)質(zhì)譜確認(rèn)結(jié)構(gòu)正確。然后通過明膠海綿-雞胚尿囊膜(gelatin sponge-CAM)實(shí)驗(yàn)對(duì)上述三種NK3R激動(dòng)劑及其類似物進(jìn)行抗血管生成作用的研究,并運(yùn)用拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]進(jìn)行相應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn),以驗(yàn)證它們的作用機(jī)制;其次通過體外的MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及兩種經(jīng)典的遷移實(shí)驗(yàn),對(duì)這三種NK3R激動(dòng)劑及其類似物進(jìn)行體外的抗血管生成研究,同時(shí)利用[Gly6]NKB[3-10]進(jìn)行相應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)探討其作用機(jī)制;另外,本研究還進(jìn)行了體內(nèi)小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃兔庖呓M織化學(xué)(IHC)染色實(shí)驗(yàn)對(duì)經(jīng)過藥物處理的腫瘤組織進(jìn)行結(jié)果分析。并最終對(duì)待測(cè)多肽類藥物的抑瘤效果和抗腫瘤血管生成作用進(jìn)行評(píng)估。研究結(jié)果以Fmoc固相多肽合成方法合成了NK3R激動(dòng)劑及其類似物[MePhe7]NKB(Asp-Met-His-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2)、NK3R-A1(Asn-Gly-Arg-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2)、NK3R-A2(Cys-Asn-Gly-Arg-Cys-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2)以及NK3R選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10](His-Asp-Phe-Gly-Val-Gly-Leu-Met-NH2),以反相高效液相色譜儀純化,質(zhì)譜鑒定證明分子量正確。進(jìn)一步的gelatin sponge-CAM實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,上述三種NK3R激動(dòng)劑及其類似物都體現(xiàn)出了抗血管生成作用。用NK3R選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]預(yù)處理后,三種多肽的抗血管生成作用均被抑制。隨后進(jìn)入體外研究,MTT細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,三種被檢測(cè)多肽在24小時(shí)內(nèi)對(duì)HUVECs的增殖沒有明顯的影響,但藥物作用大于24小時(shí)后,出現(xiàn)了一定的細(xì)胞殺傷作用,因此在后續(xù)的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中藥物處理時(shí)間限時(shí)在24小時(shí)之內(nèi)。在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,50μM的[MePhe7]NKB、25μM的NK3R-A1和NK3R-A2在藥物作用24小時(shí)時(shí)體現(xiàn)了最好的抑制HUVECs遷移的效果。抑制率分別達(dá)到了20.0%、73.2%以及53.7%;Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中也得到了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,陰性對(duì)照組的遷移細(xì)胞數(shù)目分別是5μM的[MePhe7]NKB、NK3R-A1與NK3R-A2的2.3倍、5.0倍和7.0倍,三種多肽都體現(xiàn)出了在體外很好的抑制HUVECs遷移的效果,證明了它們?cè)隗w外的抗血管生成作用。值得注意的是,NK3R-A1與NK3R-A2在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中相較于[MePhe7]NKB,具有更好的抗血管生成作用。聯(lián)合應(yīng)用拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]對(duì)HUVECs進(jìn)行預(yù)處理后,三種多肽的抗血管生成作用被明顯抑制,證明其抗血管生成作用是通過NK3R通路介導(dǎo)的。細(xì)胞劃痕競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)中,NK3R-A1與NK3R-A2拮抗組的“愈合程度”分別達(dá)到了96.3%和97.6%,[MePhe7]NKB拮抗組的“愈合程度”幾乎達(dá)到和陰性對(duì)照組相同的水平,說明三種檢測(cè)多肽的抗血管生成作用幾乎被完全拮抗;Transwell細(xì)胞遷移競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,拮抗組的遷移細(xì)胞數(shù)目分別是[MePhe7]NKB、NK3R-A1與NK3R-A2單獨(dú)處理組的3.9倍、2.8倍和3.3倍,依舊在一定程度上拮抗了NK3R激動(dòng)劑及其類似物的抗血管生成作用。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,和生理鹽水組相比,經(jīng)過三種NK3R激動(dòng)劑及其類似物高低劑量組處理后,瘤組織體積在給藥期間顯著減小,較陰性對(duì)照組瘤體積減小50%左右。第15天,小鼠脫頸處死,取出瘤組織進(jìn)行稱重,發(fā)現(xiàn)所有的藥物處理組的瘤重均明顯小于生理鹽水組,其中以[MePhe7]NKB的高劑量組和NK3R-A1的低劑量組表現(xiàn)出了更好的抑制效果,抑瘤率均達(dá)到了~60%。而IHC染色的結(jié)果也顯示出,藥物處理組的微血管密度(MVD)相比于陰性對(duì)照組有著明顯的減少。值得注意的是,NK3R-A1與NK3R-A2藥物處理組的MVD值相較于[MePhe7]NKB有所減少,說明了前兩者具有一定的抗腫瘤血管生成作用。研究結(jié)論綜上所述,本論文通過對(duì)NK3R激動(dòng)劑及其類似物[MePhe7]NKB、NK3R-A1和NK3R-A2的抗血管生成作用及其機(jī)制的研究,為基于抗新生血管生成策略的抗腫瘤方法學(xué)的研究提供了一種全新的藥物靶點(diǎn)NK3R,并且發(fā)現(xiàn)了一種具有潛力的抗血管生成藥物的模板分子NK3R-A1。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R730.5

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本文編號(hào)：2573653