【摘要】：目的:缺血性腦中風是一類嚴重危害人類身體健康的心腦血管疾病。大量研究證明線粒體在缺血再灌注階段的神經細胞程序性死亡過程中發(fā)揮重要作用,并已成為一個有效干預腦中風神經損傷的新靶點。沒食子酸(Gallic acid,GA)是一種來源于掌葉大黃、大葉桉、山茱萸等植物的一種多酚類化合物,具有顯著的抗氧化功效。為進一步研究GA是否具有對抗缺血性腦中風作用,并論證其作用是否與靶向線粒體有關,進行了本研究,本研究將為GA應用于缺血性腦中風提供了新的理論基礎和實驗依據(jù)。方法:為研究GA對缺血性腦中風的藥效學效應,在第一部分在體試驗中采用大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)的方法建立實驗性缺血性腦中風模型,分設假手術組(Sham)、模型組(MCAO)、MCAO+GA 25 mg/kg組、MCAO+GA 50mg/kg組、MCAO+CSA 10 mg/kg組,比色法檢測缺血半暗帶神經細胞SOD活力,HE染色檢測腦組織細胞變化,TTC法檢測腦梗死體積,TUNEL染色法檢測神經元凋亡情況,Western blot法檢測檢測Cyt C的釋放水平。離體試驗部分,采用Na_2S_2O_4法構建缺氧復氧損傷細胞模型,分別預作用以不同濃度的GA(0.1、1、10μmol/L)后,MTT法檢測細胞活性,DCFH-DA熒光探針法檢測ROS含量,Mitosox red熒光探針法檢測線粒體ROS,Clark氧電極測細胞耗氧量,熒光素酶法測細胞內ATP含量。通過以上試驗系統(tǒng)評價GA的抗缺血性腦中風作用,并對其是否具有保護線粒體功能的性質進行初步探討。為進一步明確GA保護線粒體功能的相關位點,在第二部分離體實驗試驗中采用H_2O_2法構建了細胞mPTP開放模型,MTT法檢測細胞活性,Annexin V-FITC/PI流式細胞儀檢測細胞凋亡水平,JC-1染色、Calcein AM-CoCl_2和Cyt C免疫染色評估m(xù)PTP的開放程度,比色法檢測細胞SOD活力及MDA含量,Western blot法檢測Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9,以及Cyt C的釋放水平。在體試驗部分,提取小鼠離體肝臟線粒體,Calcium Green5N熒光標記后,使用瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀檢測離體線粒體對鈣離子的攝取能力。通過以上試驗,系統(tǒng)評價了GA靶向mPTP保護線粒體功能的作用。為明確GA作用mPTP的相關作用機制,在第三部分在體試驗中提取小鼠離體肝臟線粒體,Ca~(2+)刺激離體線粒體后,免疫共沉淀法檢測CypD與ANT-1的結合程度,酶標儀檢測GA對CypD的氨基脯氨酸順反異構酶活性的影響,建立MCAO模型,TTC法檢測腦梗死體積,離體實驗試驗中采用H_2O_2法構建了細胞mPTP開放模型,Western blot檢測Cleaved caspase-3、CypD、p-ERK的表達水平,Calcein AM-CoCl_2染色評估m(xù)PTP的開放程度,最后采用ERK通路抑制劑U0126分別從在體和離體兩個層面反向驗證以上GA作用是否是通過調控ERK通路發(fā)揮保護作用。結果:在第一部分中,本研究組發(fā)現(xiàn)GA可有效對抗MCAO及Na_2S_2O_4所致的神經細胞缺氧復氧損傷。與模型組相比,GA50 mg/kg組大鼠大腦梗死體積,TUNEL陽性細胞數(shù),Cyt C釋放量均顯著性下降,此外,預防性給予GA后大鼠腦神經細胞SOD水平有顯著性升高,這些結果均提示GA具有良好的對抗腦缺血再灌注損傷的作用。重要的是GA的這些神經保護作用可能與其保護線粒體功能密切相關,與模型組相比,GA可顯著性抑制Na_2S_2O_4所致的線粒體膜電位下降、ATP含量以及耗氧量的減少、細胞總ROS水平以及線粒體ROS的增加,這些結果表明GA具有對抗缺血性腦中風的作用,且與其保護神經細胞線粒體功能密切相關。在第二部分中,本研究組發(fā)現(xiàn)GA保護線粒體對抗缺氧損傷與其作用mPTP,提高線粒體鈣閾值水平有關。與對照組相比,500μmol/L H_2O_2作用后,細胞內Calcein AM水平下降,膜電位水平降低,Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達水平升高,Cyt C釋放增加表明SH-SY5Y細胞mPTP開放。預作用GA后可顯著性逆轉H_2O_2誘導的SH-SY5Y細胞mPTP開放,促進細胞的存活,抑制其細胞凋亡的發(fā)生。離體小鼠肝臟線粒體鈣攝取能力試驗結果顯示,與對照組相比,GA作用后線粒體鈣攝取能力顯著性升高,以上結果證明mPTP是GA保護線粒體功能的靶點之一。在第三部分中,本研究組發(fā)現(xiàn),與對照組相比,GA作用后CypD氨基脯氨酸順反異構酶活性顯著性升高,而在離體小鼠肝臟線粒體中Cy PD-ANT-1復合物水平顯著下降。有趣的是,在EGF誘導以及MCAO損傷刺激條件下,伴隨著ERK磷酸化水平的升高,SH-SY5Y細胞中CypD表達水平顯著性下降,且采用U0126抑制ERK磷酸化后,GA對抗H_2O_2誘導的mPTP開放以及MCAO誘導的腦缺血損傷效應均被逆轉,與單用GA組相比,聯(lián)合GA和U0126組細胞內Calcein AM水平顯著性下降,Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達水平升高,腦梗死體積顯著性升高。這些結果表明GA一方面直接影響CypD氨基脯氨酸順反異構酶活性,抑制其于ANT-1結合,另一方面通過作用ERK磷酸化水平,反向抑制CypD的表達,提高mPTP的開放閾值,發(fā)揮其神經保護作用。結論:GA通過直接影響CypD與ANT-1結合及影響ERK磷酸化水平,抑制CypD表達,提高線粒體mPTP開放閾值,有效對抗缺血性腦中風病理過程中神經細胞損傷。鑒于mPTP在多種氧化應激損傷過程中的關鍵作用,GA可能成為該類疾病的潛在治療藥物,其成藥性值得進一步研究。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王永香;缺血性腦中風證治[J];黑龍江中醫(yī)藥;2002年06期

2 ;老年人飲灑與缺血性腦中風的關系[J];高血壓雜志;2005年12期

3 李云;;缺血性腦中風是怎樣發(fā)生的[J];山西老年;2008年07期

4 張福先;缺血性腦中風的預防與治療[J];山西老年;2004年08期

5 楊鋒;缺血性腦中風的防治[J];醫(yī)藥與保健;1997年09期

6 何秀波,周圣蘭;彩色多普勒超聲頸動脈探查對缺血性腦中風應用的探討[J];中國超聲診斷雜志;2000年01期

7 駱利萍;缺血性腦中風護理體會[J];內蒙古中醫(yī)藥;2004年06期

8 徐德鳳;缺血性腦中風的中西醫(yī)結合防治[J];中國臨床醫(yī)生;2005年08期

9 趙孔華;張沁園;;缺血性腦中風的發(fā)病機理探討[J];河南中醫(yī);2006年07期

10 李留霞;;論缺血性腦中風的發(fā)病機理[J];光明中醫(yī);2007年05期

相關會議論文 前6條

1 彭麗華;;地壇牌清開靈注射液治療缺血性腦中風[A];心腦病藥物臨床評價專家談[C];1998年

2 王秀琴;肖榕林;鐘麗紅;徐西元;;補腎益腦治療缺血性腦中風的機理研究[A];第五次全國中西醫(yī)結合神經科學術會議論文集[C];2004年

3 沈介明;熊立凡;;缺血性腦中風患者的活化蛋白C抵抗現(xiàn)象[A];第七屆全國老年醫(yī)學學術會議暨海內外華人老年醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2004年

4 蔡少青;楊東輝;徐風;屠鵬飛;吳軍;李長齡;張杰;盧景芬;李晨旭;尚明英;趙玉英;廖福龍;韓東;杜貴友;王秀榮;;中藥復方-補陽還五湯治療缺血性腦中風有效成分及作用機理的研究進展[A];第八屆全國中藥和天然藥物學術研討會與第五屆全國藥用植物和植物藥學學術研討會論文集[C];2005年

5 楊迎民;;加味四逆散治療缺血性腦中風后抑郁癥臨床觀察[A];2008年浙江省物理醫(yī)學與康復學術年會暨中樞神經功能損傷康復新進展學習班論文匯編[C];2008年

6 楊迎民;;加味四逆散治療缺血性腦中風后抑郁癥臨床研究[A];2011年浙江省物理醫(yī)學與康復學學術年會暨康復新進展學習班論文匯編[C];2011年

相關重要報紙文章 前10條

1 姜維;炎夏老年人須防缺血性腦中風[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2005年

2 ;老人頻打哈欠可能是缺血性腦中風前兆[N];醫(yī)藥導報;2009年

3 楊子;醫(yī)學界首次發(fā)現(xiàn)能夠有效預防缺血性腦中風的藥物[N];醫(yī)藥經濟報;2004年

4 貢小兵;莫將中風當“春困”[N];中國中醫(yī)藥報;2006年

5 本報記者　 孫燕明;高溫酷暑易導致 出血性和缺血性腦中風[N];中國消費者報;2006年

6 錢勇;警惕活動頭頸造成缺血性腦中風[N];科技日報;2005年

7 王修增;哈欠頻頻當心中風發(fā)生[N];大眾衛(wèi)生報;2005年

8 芳 伊;當心 哈欠頻頻藏隱患[N];中國中醫(yī)藥報;2006年

9 張乾;謹防藥物性中風[N];中國醫(yī)藥報;2005年

10 主任醫(yī)師 黃清;哈欠連天 預示腦中風[N];保健時報;2005年

相關博士學位論文 前5條

1 朱利瑞;缺血性腦中風對小鼠神經元突觸結構變化的影響[D];蘭州大學;2016年

2 李明利;缺血性腦中風危險因素的影像學檢測[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2004年

3 賴鴻銘;頭針治療缺血性腦中風機制探討[D];廣州中醫(yī)藥大學;2000年

4 張?zhí)N莉;缺血性腦中風與E-selectin、ICAM-1及CX3CR1基因多態(tài)性的相關性研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學;2008年

5 李宏艷;二氧化氮與缺血性腦中風和血管性癡呆的相關性及其分子機制研究[D];山西大學;2013年

相關碩士學位論文 前8條

1 戴培敏;ET-1誘導獼猴手指運動區(qū)缺血性腦中風模型及損傷后恢復的研究[D];昆明醫(yī)科大學;2015年

2 任大堆;沒食子酸抗缺血性腦中風作用及其線粒體機制研究[D];江蘇大學;2017年

3 侯麗;SO_2吸入誘導缺血性腦中風發(fā)生發(fā)展的分子機制研究[D];山西大學;2010年

4 Srikakula Srikanth;缺血性腦中風患者氧攝取分數(shù)與臨床癥狀的相關性研究[D];大連醫(yī)科大學;2012年

5 榮加國;RIP_1K通過激活自噬—溶酶體途徑介導缺血性腦中風神經元necroptosis[D];蘇州大學;2014年

6 胡曉菡;缺血性腦中風Src通過抑制蛋白磷酸酶2A調節(jié)ERK信號級聯(lián)機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2010年

7 許莉;KZF（抗中風膠囊）對缺血性腦中風鼠的治療作用及機制[D];蘇州大學;2012年

8 陳春曉;先導化合物TMP-VA抗缺血性腦中風的藥理活性及作用機理的研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2013年

，

本文編號：2571676