【摘要】：研究背景和目的:抑郁癥具有高發(fā)病率和高死亡率特點嚴(yán)重危害人類生產(chǎn)生活,目前,抑郁癥的發(fā)病機理仍不十分清楚,安全有效臨床治療抑郁藥物相對匱乏。本課題組及其他學(xué)者前期研究表明,抑郁癥發(fā)生發(fā)展與中樞神經(jīng)炎癥密切相關(guān)。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐免疫細(xì)胞,當(dāng)機體感受到內(nèi)源性和/或外源性危險信號時,小膠質(zhì)細(xì)胞可被迅速激活,釋放大量炎性細(xì)胞因子,清除危險信號,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。抑郁癥尸檢報告顯示患者前扣帶回皮層小膠質(zhì)細(xì)胞激活和炎性細(xì)胞因子增加。本課題組前期在抑郁癥模型動物前額皮層功能腦區(qū)上觀察到類似現(xiàn)象,提示小膠質(zhì)細(xì)胞激活及合成釋放炎性細(xì)胞因子可能是引發(fā)抑郁癥中樞神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。應(yīng)激是抑郁癥發(fā)生發(fā)展的重要誘因,本課題組在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)抑郁癥模型大鼠上檢測到下丘腦-垂體-腎上腺軸激活,糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)酮水平升高,但所升高的糖皮質(zhì)激素與中樞小膠質(zhì)細(xì)胞激活及其介導(dǎo)神經(jīng)炎癥之間是否存在內(nèi)在聯(lián)系?作為經(jīng)典的免疫抑制劑和抗炎劑,糖皮質(zhì)激素可通過何種機制激活小膠質(zhì)細(xì)胞和增強其介導(dǎo)的神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)?這些問題亟待探究。之前有研究證實,慢性應(yīng)激或外源性糖皮質(zhì)激素預(yù)處理動物后,分離海馬小膠質(zhì)細(xì)胞并給予炎性因子刺激,可檢測到更快更強的免疫炎癥反應(yīng),提示糖皮質(zhì)激素除經(jīng)典的抗炎作用外,還可能導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞處于"啟動增強"(priming)狀態(tài),從而對隨后炎性因子刺激產(chǎn)生了更強的炎性應(yīng)答反應(yīng)。目前對這一現(xiàn)象及其可能的機制探究仍不充分。另一方面,臨床和基礎(chǔ)研究已證實淫羊藿黃酮類成分具有增強免疫功能、抗抑郁行為樣作用,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿黃酮類成分可改善下丘腦-垂體-腎上腺軸功能而發(fā)揮其抗抑郁作用,但這些成分對應(yīng)激水平皮質(zhì)酮所引起的小膠質(zhì)細(xì)胞病理改變的逆轉(zhuǎn)作用及其分子作用機制需進一步闡明。本文擬利用應(yīng)激水平糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)酮)體外刺激小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞,確證其啟動增強小膠質(zhì)細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)的可能作用模式與機制。并在上述模型上,評價淫羊藿黃酮類成分對皮質(zhì)酮啟動增強小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控作用和機制,以發(fā)現(xiàn)基于干預(yù)啟動增強狀態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞新途徑的潛在抗抑郁中藥成分。實驗方法:皮質(zhì)酮(25 nM)預(yù)處理小鼠小膠質(zhì)瘤BV2細(xì)胞24 h后,加入不同濃度的炎性因子脂多糖(LPS)1、5、10、50和100 ng/mL處理4 h,采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(q-PCR)方法檢測細(xì)胞中白細(xì)胞介素1β(IL-M)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA表達水平;皮質(zhì)酮(25nM)預(yù)處理BV2細(xì)胞24 h后,加入LPS(5ng/mL)處理2h,采用免疫印跡(Western blotting)方法檢測細(xì)胞核內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)P65和全細(xì)胞NF-κB p-p65蛋白水平;皮質(zhì)酮(25 nM)預(yù)處理BV2細(xì)胞24 h后,加入LPS(5 ng/mL)處理,在不同時間點上采用Western blotting方法檢測總IL-1β、IL-1β成熟體蛋白水平以及Nod樣受體蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)蛋白水平;皮質(zhì)酮(25 nM)預(yù)處理BV2細(xì)胞24h后,Western blotting檢測NLRP3蛋白水平;采用q-PCR方法檢測皮質(zhì)酮(25 nM)預(yù)處理BV2細(xì)胞24 h后糖皮質(zhì)激素受體靶基因NLRP3、SGK、GILZ、MKP-1的mRNA表達水平。利用混合膠質(zhì)細(xì)胞搖床法提取分離純化Sprague-Dawley新生大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞,采用免疫熒光化學(xué)法標(biāo)記離子鈣接頭分子蛋白-1(Iba-1)檢測所獲得的原代小膠質(zhì)細(xì)胞純度;同時采用q-PCR方法檢測皮質(zhì)酮(25 nM)預(yù)處理原代小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后以及再加入LPS(5 ng/mL)處理4 h條件下,NLRP3、IL-1β和TNF-α的mRNA表達水平;采用Western blotting方法檢測皮質(zhì)酮(25nM)預(yù)處理原代小膠質(zhì)細(xì)胞24h后,加入LPS(5 ng/mL)處理2 h后,細(xì)胞p-p65蛋白水平,以及加入LPS(5 ng/mL)處理8 h后檢測IL-1β總蛋白和成熟體蛋白水平、NLRP3和Caspase-1蛋白水平。另外,皮質(zhì)酮(20mg/kg)皮下注射C57BL/6小鼠三周,采用q-PCR方法檢測小鼠海馬組織NLRP和IL-1βmRNA表達水平;采用免疫熒光化學(xué)法標(biāo)記小鼠海馬組織Iba-1和NLRP3,檢測小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達水平;采用Western blotting方法檢測小鼠海馬組織NLRP3、p-p65、總IL-1β、IL-1β成熟體和Caspase-1蛋白水平。采用MTT比色法檢測淫羊蕾黃酮類成分(淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B和朝蕾定C)處理BV2細(xì)胞24h時細(xì)胞活力變化以選擇干預(yù)劑量;采用q-PCR方法檢測皮質(zhì)酮(25dnM)預(yù)處理BV2細(xì)胞24h后,加入LPS(5 ng/mL)處理4 h時各成分對IL-1β mRNA表達水平的影響;采用Western blotting方法檢測皮質(zhì)酮(25 nM)預(yù)處理BV2細(xì)胞24h后,加入LPS(5 ng/mL)處理2 h時各成分對p-p65蛋白水平的影響及8 h時各成分對總IL-1β、IL-1β成熟體蛋白水平以及NLRP3、Caspase-1蛋白水平的影響;采用q-PCR和Western blotting方法檢測皮質(zhì)酮(25 nM)處理BV2細(xì)胞24h時各成分對NLRP3 mRNA和蛋白水平的影響。實驗結(jié)果:與空白對照組比較,皮質(zhì)酮預(yù)處理BV2細(xì)胞24 h后加入LPS處理4 h時,LPS單獨處理組細(xì)胞IL-1β(p0.001)和TNF-α(p0.001)的mRNA表達水平顯著升高,皮質(zhì)酮處理組則無顯著性變化(p0.05);而與LPS單獨處理組比較,皮質(zhì)酮預(yù)處理+LPS處理組IL-1β(p0.05)和TNF-α(p0.05)的mRNA表達水平則進一步顯著升高。與之一致的是,與空白對照組比較,LPS單獨處理組細(xì)胞核內(nèi)p65(p0.01)和全細(xì)胞p-p65(p0.05)蛋白水平顯著升高;而與LPS單獨處理組比較,皮質(zhì)酮預(yù)處理+LPS處理組細(xì)胞核內(nèi)p65(p0.05)和全細(xì)胞p-p65(p0.05)的蛋白水平進一步顯著升高。皮質(zhì)酮預(yù)處理BV2細(xì)胞24 h后,加入5 ng/mL的LPS處理8 h時,與空白對照組比較,LPS單獨處理組細(xì)胞總 IL-1β(p0.01)、IL-1β 成熟體(p0.001)以及 NLRP3(p0.01)和Caspase-1(p0.001)蛋白水平顯著升高;而與LPS單獨處理組比較,皮質(zhì)酮預(yù)處理+LPS處理組總 IL-1β(p0.01)、IL-1β 成熟體(p0.001)以及 NLRP3(p0.05)和Caspase-1(p0.001)蛋白水平顯著升高。值得注意的是,與空白對照組比較,皮質(zhì)酮預(yù)處理BV2細(xì)胞24h即可誘導(dǎo)NLRP3(p0.05)、糖皮質(zhì)激素受體其它靶基因SGK(p0.05)、GILZ(p0.05)和 MKP-1(p0.05)mRNA 以及NLRP3蛋白(p0.01)水平顯著升高。另外,在原代Sprague-Daw1ey大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞上觀察到類似的現(xiàn)象:皮質(zhì)酮(25 nM)預(yù)處理原代小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后,加入LPS(5 ng/mL)處理4 h時,與空白對照組比較,LPS單獨處理組IL-1β(p0.05)和TNF-α(p0.001)mRNA表達水平顯著升高,皮質(zhì)酮處理組則無顯著性變化(p0.05);而與LPS單獨處理組比較,皮質(zhì)酮預(yù)處理+LPS處理組的IL-1β(p0.01)和TNF-α(p0.01)mRNA表達水平顯著升高。與空白對照組比較,LPS單獨處理組p-p65蛋白水平顯著升高(p0.05),而與LPS單獨處理組比較,皮質(zhì)酮預(yù)處理+LPS處理組p-p65蛋白水平進一步顯著升高(p0.05)。皮質(zhì)酮預(yù)處理原代小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后,加入LPS處理8h時,與空白對照組比較,LPS單獨處理組總IL-1βp(p0.01)、IL-1β 成熟體(p0.05)以及NLRP3(p0.01)和 Caspase-1(p0.05)蛋白水平顯著升高;而與LPS單獨處理組比較,皮質(zhì)酮預(yù)處理+LPS處理組總IL-1β(p0.05)、IL-1β 成熟體(p0.01)以及 NLRP3(p0.01)和 Caspase-1(p0.01)蛋白水平顯著升高;同時與空白對照組相比,皮質(zhì)酮預(yù)處理原代小膠質(zhì)細(xì)胞24h可誘導(dǎo)NLRP3mRNA(p0.01)和蛋白(p0.01)表達水平顯著升高。皮質(zhì)酮(20mg/kg)皮下注射(5mL/kg)C57BL/6小鼠三周,與空白對照組比較,小鼠海馬組織NLRP3mRNA(p0.01)和蛋白(p0.001)表達水平顯著升高;免疫熒光化學(xué)法初步結(jié)果顯示小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3表達量升高,而對1L-1βmRNA表達水平和p-p65、總IL-1β、IL-1β成熟體和Caspase-1蛋白水平無顯著影響。通過MTT法以處理BV2細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力大于80%為標(biāo)準(zhǔn)確定各個中藥成分的干預(yù)劑量:淫羊藿苷和寶蕾苷Ⅰ均為2.5、5和10μM;朝蕾定A、朝蕾定B和朝蕾定C均為0.25、0.5和1μM。皮質(zhì)酮(25 nM)+各中藥成分預(yù)處理BV2細(xì)胞24h后,加入5ng/mL LPS處理4h時,淫羊藿苷(p0.01)、寶藿苷Ⅰ(p0.001)、朝藿定 A(p0.01)、朝藿定B(p0.05)和朝蕾定C(p0.01)顯著下調(diào)BV2細(xì)胞IL-1β mRNA表達水平。同時,在皮質(zhì)酮+中藥成分預(yù)處理BV2細(xì)胞24h后,LPS處理2h時,淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、朝蕾定A、朝藿定B和朝藿定C顯著下調(diào)p-p65蛋白水平(p0.01)。皮質(zhì)酮+中藥成分預(yù)處理BV2細(xì)胞24h后,LPS處理8h時,淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、朝蕾定A、朝藿定B和朝藿定 C 顯著下調(diào) NLRP3(p0.01)、Caspase-1(p0.01)、總 IL-1β(p0.01)和IL-1β成熟體(p0.01)蛋白水平。皮質(zhì)酮+中藥成分處理BV2細(xì)胞24h時,朝藿定A、朝藿定B和朝蕾定C顯著下調(diào)NLRP3mRNA(p0.05)和蛋白(p0.05)表達水平,而淫羊藿苷和寶蕾苷Ⅰ對模型細(xì)胞NLRP3mRNA和蛋白水平無顯著影響(p0.05)。小結(jié):本文研究結(jié)果表明,皮質(zhì)酮預(yù)處理可通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3mRNA和蛋白表達,使之對隨后LPS刺激產(chǎn)生更強更迅速的炎癥應(yīng)答,顯示出啟動增強(priming)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)的效應(yīng)。淫羊蕾黃酮類成分淫羊蕾苷、寶蕾苷Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C可通過抑制p-p65蛋白水平和NLRP3炎癥小體的激活改善皮質(zhì)酮primingLPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng);其中朝藿定A、朝藿定B和朝蕾定C可通過下調(diào)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)NLRP3mRNA和蛋白表達,抑制NLRP3炎癥小體的激活,從而改善皮質(zhì)酮對LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng)的priming效應(yīng)。本文研究工作在一定程度上闡述了應(yīng)激狀態(tài)下糖皮質(zhì)激素對小膠質(zhì)細(xì)胞炎性priming效應(yīng)機制,發(fā)現(xiàn)淫羊藿黃酮類成分的逆轉(zhuǎn)作用,為淫羊蕾防治中樞神經(jīng)炎癥及應(yīng)激相關(guān)抑郁癥等提供了實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2561087