【摘要】：本論文在國家基金項目《水蛭酶解物抗凝活性肽類物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究》的研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對我國市場上的主流水蛭品種-螞蟥的酶解物的抗凝活性成分進(jìn)行了探究,同時研究了不同品種水蛭的抗凝作用機(jī)制,主要實驗方法及結(jié)果如下所述。一.螞蟥酶解物抗凝活性肽類物質(zhì)研究1.螞蟥酶解物不同分子量部位的獲得及其抗凝活性采用分級超濾法,得到螞蟥酶解物中的不同分子量肽段,以凝血酶時間(TT)為指標(biāo),測定各肽段的抗凝活性;同時以外翻腸囊為模型,確定螞蟥酶解物中分子量大于10 KD肽段與分子量小于10 KD肽段經(jīng)腸吸收后的抗凝活性。結(jié)果:螞蟥酶解物抗凝活性分散,其分子量小于10 KD的肽段雖然表現(xiàn)出較弱的體外抗凝活性,但經(jīng)腸吸收后其活性反而更加顯著。結(jié)論:螞蟥酶解物發(fā)揮抗凝活性的物質(zhì)應(yīng)集中在分子量較小的肽類中。2.螞蟥酶解物不同極性部位的獲得及其抗凝活性采用C18反相色譜法對螞蟥酶解物中分子量小于10 KD部位進(jìn)行進(jìn)一步分離,以凝血酶時間(TT)為抗凝活性指標(biāo),測定所得各組分的抗凝活性;以外翻腸囊為模型,研究各組分經(jīng)大鼠的腸吸收后的抗凝活性。結(jié)果:螞蟥酶解物中分子量小于10kd部位中的大極性部位(LF0-1)體外抗凝活性更好,且更容易被腸吸收。結(jié)論:螞蟥酶解物經(jīng)兩步分離后得到了一個抗凝活性部位LF0-1。3.螞蟥酶解物抗凝活性部位的多肽成分分析通過超濾法、C18反相柱層析法后,從螞蟥酶解物中分離得到一個抗凝活性較顯著的部位,即LF0-1,本論文將此部位進(jìn)行LTQ-Obitrap質(zhì)譜分析,得到多個多肽蛋白的數(shù)據(jù)信息,將此數(shù)據(jù)采用uniprot軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索匹配。結(jié)果:通過質(zhì)譜分析后,得到五千多個肽段信息,但是由于水蛭已知蛋白多肽結(jié)構(gòu)較少,數(shù)據(jù)庫不完整,無法比對,通過已有庫搜索,只鑒定出42個多肽、26個蛋白。結(jié)論:螞蟥酶解物成分復(fù)雜,其抗凝物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步研究。4.螞蟥酶解物中凝血酶直接抑制劑的分離采用本課題組前期制備的一種凝血酶-親和色譜,篩選螞蟥酶解物中的抗凝血酶成分,并測定所得成分與凝血酶的作用及其抗凝血活性。結(jié)果:螞蟥酶解物經(jīng)親和色譜法分離所得成分不具有凝血酶抑制活性和抗凝血活性。結(jié)論:凝血酶可能不是螞蟥抗凝的作用靶點。二.不同品種水蛭對凝血途徑的作用研究選擇螞蟥清水吊干品、干品菲牛蛭、鮮品菲牛蛭三種水蛭,參照《中國藥典》的凝血酶滴定法評價三者的抗凝血活性;采用凝固法測定三者的部分凝血酶原時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)。結(jié)果:凝血酶滴定法結(jié)果表明不同水蛭的抗凝活性順序依次為:鮮品菲牛蛭干品菲牛蛭螞蟥清水吊干品;凝固法測定結(jié)果顯示不同水蛭樣品均使APTT、PT、TT延長,鮮品菲牛蛭主要延長TT,干品菲牛蛭主要延長APTT,螞蟥清水吊干品使APTT、TT延長更加顯著。結(jié)論:不同品種水蛭的抗凝活性差異較大,且對凝血途徑的影響不同。三.不同品種水蛭對凝血共同途徑的作用機(jī)制研究1.不同品種水蛭對凝血酶的作用研究首先,采用發(fā)色底物法測定螞蟥酶解物的抑凝血酶活性;其次,采用發(fā)色底物法-萃取-HPLC法測定螞蟥酶解物、螞蟥清水吊干品、干品菲牛蛭及鮮品菲牛蛭對凝血酶的作用。結(jié)果:螞蟥酶解物中由于胰蛋白酶的干擾無法測定其對凝血酶的作用,而螞蟥清水吊干品、干品菲牛蛭及鮮品菲牛蛭三種水蛭提取物對凝血酶的作用均表現(xiàn)出低濃度促進(jìn),高濃度抑制,且菲牛蛭具有強(qiáng)烈凝血酶抑制活性,而螞蟥在加入更高劑量時才表現(xiàn)出抑制作用,且抑制作用較弱。結(jié)論:本實驗首次明確水蛭對凝血酶的作用表現(xiàn)出低濃度促進(jìn),高濃度抑制,且螞橫對凝血酶的抑制作用更弱。2.不同品種水蛭對纖維蛋白原的作用研究選擇螞蟥清水吊干品、干品菲牛蛭、鮮品菲牛蛭三種水蛭,采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法檢測三種水蛭對纖維蛋白原的作用。結(jié)果:螞蟥能夠水解纖維蛋白原,對α、Β鏈作用較強(qiáng),干品與鮮品菲牛蛭均對纖維蛋白原無作用。結(jié)論:不同品種水蛭對纖維蛋白原作用不同,螞蟥具有裂解纖維蛋白原的作用。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R284;R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2518230