【摘要】：目的意義卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)指婦女40歲之前出現(xiàn)的非生理性月經(jīng)停止,為臨床常見的婦科疾病,誘發(fā)一系列生殖內(nèi)分泌及健康等問題,嚴重者會喪失生殖能力。尤其隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏加快、生活壓力增大,卵巢早衰的發(fā)病率逐年升高,近年來甚至有年輕化趨勢�；熥鳛橹委熋庖咝约膊『湍[瘤的常用手段,療效確切,廣泛應用于臨床;但化療藥物對靶細胞選擇性較差,不僅殺死病變細胞,對正常組織和細胞也會造成不同程度的損傷。隨著化療導致卵巢功能低下和不孕的報道日漸增多,化療作為引發(fā)POF重要原因之一日益受到人們的關注。順鉑(cisplatin,CDDP)即為臨床常用的化療藥物,有不少報道稱其對卵泡發(fā)育有一定損傷,并具有卵巢毒性。本實驗室在前期研究中已成功建立了順鉑誘導卵巢早衰的動物模型。FOX03a轉(zhuǎn)錄因子為FOXO蛋白家族的成員之一,參與細胞的增殖、生長、分化、凋亡及衰老等重要生命過程的調(diào)控。此外,FOX03a轉(zhuǎn)錄因子是磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶 B(phosphatidylinositol-3-kinase-protein-kinaseB,PI3K-AKT)信號通路下游的重要靶蛋白之一,通過調(diào)節(jié)非特異性周期依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)P27kip1和前凋亡蛋白Bim來調(diào)控細胞周期及細胞凋亡。中醫(yī)驗方二仙湯是補腎常用方藥,現(xiàn)代藥理研究表明其對性腺、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)、骨質(zhì)疏松等均具有顯著的改善作用,臨床上普遍應用于婦女圍絕經(jīng)期綜合癥、更年期高血壓、絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松、前列腺炎等疾病的治療,對卵巢早衰也有顯著療效。目前對二仙湯的實驗研究大多為在體動物模型的形態(tài)學觀察及生理生化指標的檢測,而分子機制方面的研究少有報道。二仙湯治療化療損傷性卵巢早衰的分子作用機制尚未闡明,尤其基于FOX03a轉(zhuǎn)錄因子探討二仙湯對順鉑損傷卵巢顆粒細胞的分子保護機制國內(nèi)尚未有研究。本實驗以離體大鼠卵巢顆粒細胞為研究對象,基于FOX03a-P27kip1/Bim途徑探討補腎驗方二仙湯對卵巢顆粒細胞增殖及凋亡的作用機制,以期為二仙湯應用于臨床治療卵巢早衰提供更為詳實有力的理論依據(jù)。研究方法提取原代大鼠卵巢顆粒細胞,利用順鉑制備顆粒細胞損傷模型,分別給予正常、戊酸雌二醇、二仙湯高、中、低劑量藥理血清(大鼠源),觀察二仙湯藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細胞的干預效果:MTT法檢測二仙湯藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細胞增殖的影響;流式細胞術檢測二仙湯藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細胞周期及凋亡的影響;免疫組織化學法檢測二仙湯藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細胞中FOXO3a、P27kip1、Bim表達定位的影響,同時加入LY294002抑制劑,進一步驗證二仙湯藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細胞的保護機制是否與調(diào)控FOXO3a及P27kip1、Bim的表達有關;蛋白印跡法檢測二仙湯藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細胞中FOX03a、P27kip1、Bim表達水平的影響。研究結(jié)果1.二仙湯對順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細胞增殖的影響二仙湯各劑量藥理血清對順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細胞均具有明顯的增殖促進作用,其中,中劑量組效果最為顯著;藥理血清的增殖促進作用一直持續(xù)到72h,且以48h作用效果最為顯著。因此本研究選擇48h為藥理血清作用時間。2.二仙湯對順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細胞周期及凋亡的影響(1)二仙湯各劑量藥理血清均能影響順鉑損傷卵巢顆粒細胞的周期時相變化:使S期細胞顯著增多,Go/G1期細胞相對減少,增殖指數(shù)升高。各劑量組間無差異,其中低劑量組增殖效果較好。(2)二仙湯各劑量藥理血清均能降低順鉑損傷卵巢顆粒細胞的凋亡率,中劑量組效果最為顯著。3.二仙湯對順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細胞中FOXO3a/P27kip1/Bim蛋白表達的影響(1)FOXO3a在胞質(zhì)胞核內(nèi)均有表達,P27kip1主要表達于胞核,Bim主要表達于胞質(zhì);順鉑誘導FOXO3a在胞核內(nèi)的表達,核內(nèi)陽性顆粒明顯增多,同時誘導P27kip1、Bim高表達,二仙湯各劑量組則均能明顯降低三者陽性顆粒的表達;平均光密度分析結(jié)果顯示,模型組與正常組相比,FOXO3a、P27kip1、Bim的平均光密度均有明顯增加,而戊酸雌二醇組和二仙湯各劑量組與模型組相比,三者平均光密度值均有顯著降低,各劑量組之間無差異,以中劑量效果較好。加抑制劑LY294002各組與對應不加抑制劑各組相比,FOXO3a、P27kip1、Bim陽性顆粒的表達均明顯增加且三者的平均光密度值均有所升高。(2)蛋白印跡結(jié)果顯示,模型組與正常組相比,FOXO3a、P27kip1、Bim的相對表達量均顯著增加,而戊酸雌二醇組和二仙湯各劑量組與模型組相比,三者相對表達量均有明顯降低�？傮w上,各劑量組之間無明顯差異,低劑量效果較好。結(jié)論1.二仙湯對順鉑損傷卵巢顆粒細胞具有一定的保護作用,一方面可能是由于二仙湯能夠影響顆粒細胞周期時相,促進顆粒細胞從G0期向S期轉(zhuǎn)化,增加S期細胞比率,提高增殖指數(shù);另一方面可能是由于二仙湯能夠降低順鉑誘導的顆粒細胞凋亡。2.二仙湯通過下調(diào)FOXO3a的表達,進而下調(diào)細胞周期阻滯蛋白P27kip1及促凋亡蛋白Bim的表達,從而促進卵巢顆粒細胞增殖,抑制其凋亡,對順鉑損傷的卵巢顆粒細胞具有一定的保護作用。
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【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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1 楊琳;馬紅;;不同濃度的二仙湯及其拆方對大鼠卵泡顆粒細胞凋亡因子影響的比較研究[J];中華中醫(yī)藥學刊;2016年12期

2 楊s，

本文編號：2470267