【摘要】：目的意義卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)指婦女40歲之前出現(xiàn)的非生理性月經(jīng)停止,為臨床常見的婦科疾病,誘發(fā)一系列生殖內(nèi)分泌及健康等問題,嚴(yán)重者會(huì)喪失生殖能力。尤其隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏加快、生活壓力增大,卵巢早衰的發(fā)病率逐年升高,近年來甚至有年輕化趨勢(shì)。化療作為治療免疫性疾病和腫瘤的常用手段,療效確切,廣泛應(yīng)用于臨床;但化療藥物對(duì)靶細(xì)胞選擇性較差,不僅殺死病變細(xì)胞,對(duì)正常組織和細(xì)胞也會(huì)造成不同程度的損傷。隨著化療導(dǎo)致卵巢功能低下和不孕的報(bào)道日漸增多,化療作為引發(fā)POF重要原因之一日益受到人們的關(guān)注。順鉑(cisplatin,CDDP)即為臨床常用的化療藥物,有不少報(bào)道稱其對(duì)卵泡發(fā)育有一定損傷,并具有卵巢毒性。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中已成功建立了順鉑誘導(dǎo)卵巢早衰的動(dòng)物模型。FOX03a轉(zhuǎn)錄因子為FOXO蛋白家族的成員之一,參與細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化、凋亡及衰老等重要生命過程的調(diào)控。此外,FOX03a轉(zhuǎn)錄因子是磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶 B(phosphatidylinositol-3-kinase-protein-kinaseB,PI3K-AKT)信號(hào)通路下游的重要靶蛋白之一,通過調(diào)節(jié)非特異性周期依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)P27kip1和前凋亡蛋白Bim來調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。中醫(yī)驗(yàn)方二仙湯是補(bǔ)腎常用方藥,現(xiàn)代藥理研究表明其對(duì)性腺、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)、骨質(zhì)疏松等均具有顯著的改善作用,臨床上普遍應(yīng)用于婦女圍絕經(jīng)期綜合癥、更年期高血壓、絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松、前列腺炎等疾病的治療,對(duì)卵巢早衰也有顯著療效。目前對(duì)二仙湯的實(shí)驗(yàn)研究大多為在體動(dòng)物模型的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化指標(biāo)的檢測(cè),而分子機(jī)制方面的研究少有報(bào)道。二仙湯治療化療損傷性卵巢早衰的分子作用機(jī)制尚未闡明,尤其基于FOX03a轉(zhuǎn)錄因子探討二仙湯對(duì)順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞的分子保護(hù)機(jī)制國(guó)內(nèi)尚未有研究。本實(shí)驗(yàn)以離體大鼠卵巢顆粒細(xì)胞為研究對(duì)象,基于FOX03a-P27kip1/Bim途徑探討補(bǔ)腎驗(yàn)方二仙湯對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖及凋亡的作用機(jī)制,以期為二仙湯應(yīng)用于臨床治療卵巢早衰提供更為詳實(shí)有力的理論依據(jù)。研究方法提取原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞,利用順鉑制備顆粒細(xì)胞損傷模型,分別給予正常、戊酸雌二醇、二仙湯高、中、低劑量藥理血清(大鼠源),觀察二仙湯藥理血清對(duì)順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞的干預(yù)效果:MTT法檢測(cè)二仙湯藥理血清對(duì)順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)二仙湯藥理血清對(duì)順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞周期及凋亡的影響;免疫組織化學(xué)法檢測(cè)二仙湯藥理血清對(duì)順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞中FOXO3a、P27kip1、Bim表達(dá)定位的影響,同時(shí)加入LY294002抑制劑,進(jìn)一步驗(yàn)證二仙湯藥理血清對(duì)順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制是否與調(diào)控FOXO3a及P27kip1、Bim的表達(dá)有關(guān);蛋白印跡法檢測(cè)二仙湯藥理血清對(duì)順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞中FOX03a、P27kip1、Bim表達(dá)水平的影響。研究結(jié)果1.二仙湯對(duì)順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響二仙湯各劑量藥理血清對(duì)順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細(xì)胞均具有明顯的增殖促進(jìn)作用,其中,中劑量組效果最為顯著;藥理血清的增殖促進(jìn)作用一直持續(xù)到72h,且以48h作用效果最為顯著。因此本研究選擇48h為藥理血清作用時(shí)間。2.二仙湯對(duì)順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細(xì)胞周期及凋亡的影響(1)二仙湯各劑量藥理血清均能影響順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞的周期時(shí)相變化:使S期細(xì)胞顯著增多,Go/G1期細(xì)胞相對(duì)減少,增殖指數(shù)升高。各劑量組間無差異,其中低劑量組增殖效果較好。(2)二仙湯各劑量藥理血清均能降低順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率,中劑量組效果最為顯著。3.二仙湯對(duì)順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中FOXO3a/P27kip1/Bim蛋白表達(dá)的影響(1)FOXO3a在胞質(zhì)胞核內(nèi)均有表達(dá),P27kip1主要表達(dá)于胞核,Bim主要表達(dá)于胞質(zhì);順鉑誘導(dǎo)FOXO3a在胞核內(nèi)的表達(dá),核內(nèi)陽性顆粒明顯增多,同時(shí)誘導(dǎo)P27kip1、Bim高表達(dá),二仙湯各劑量組則均能明顯降低三者陽性顆粒的表達(dá);平均光密度分析結(jié)果顯示,模型組與正常組相比,FOXO3a、P27kip1、Bim的平均光密度均有明顯增加,而戊酸雌二醇組和二仙湯各劑量組與模型組相比,三者平均光密度值均有顯著降低,各劑量組之間無差異,以中劑量效果較好。加抑制劑LY294002各組與對(duì)應(yīng)不加抑制劑各組相比,FOXO3a、P27kip1、Bim陽性顆粒的表達(dá)均明顯增加且三者的平均光密度值均有所升高。(2)蛋白印跡結(jié)果顯示,模型組與正常組相比,FOXO3a、P27kip1、Bim的相對(duì)表達(dá)量均顯著增加,而戊酸雌二醇組和二仙湯各劑量組與模型組相比,三者相對(duì)表達(dá)量均有明顯降低�？傮w上,各劑量組之間無明顯差異,低劑量效果較好。結(jié)論1.二仙湯對(duì)順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用,一方面可能是由于二仙湯能夠影響顆粒細(xì)胞周期時(shí)相,促進(jìn)顆粒細(xì)胞從G0期向S期轉(zhuǎn)化,增加S期細(xì)胞比率,提高增殖指數(shù);另一方面可能是由于二仙湯能夠降低順鉑誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡。2.二仙湯通過下調(diào)FOXO3a的表達(dá),進(jìn)而下調(diào)細(xì)胞周期阻滯蛋白P27kip1及促凋亡蛋白Bim的表達(dá),從而促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖,抑制其凋亡,對(duì)順鉑損傷的卵巢顆粒細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 楊琳;馬紅;;不同濃度的二仙湯及其拆方對(duì)大鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡因子影響的比較研究[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2016年12期

2 楊s，

本文編號(hào)：2470267