【摘要】：目的:阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD)的發(fā)病機制目前仍未完全清楚,而β-淀粉樣肽(β-Amyloid peptide,Aβ)的神經毒性作用是AD發(fā)病過程中的關鍵環(huán)節(jié)。為此,本課題研究了 Aβ誘導小膠質細胞產生炎癥反應與氧化應激過程中信號轉導與轉錄激活子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的改變及作用。方法:用Aβ寡聚體處理BV2小膠質細胞構建了 AD細胞模型,采用siRNA方法成功沉默BV2小膠質細胞中STAT3的表達實驗分為4組,即正常對照組、Aβ處理組、ControlsiRNA+Aβ組以及siRNASTAT3+Aβ組。用CCK-8方法測定小膠質細胞的存活率以篩選Aβ寡聚體的最適刺激濃度和時間;用蛋白印跡法(Westernblotting)檢測STAT3在Aβ寡聚體誘導的BV2小膠質細胞中蛋白表達水平;用實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR)和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分別檢測ILl-β和TNF-α的mRNA與蛋白的表達水平;用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒測定細胞內ROS水平;用生物化學方法檢測一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量、超氧化物歧化酶(Antioxidant enzyme superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(Methane dicarboxylic aldehyde,MDA)含量;用流式細胞術測定細胞凋亡水平;用細胞免疫熒光方法測定細胞內Aβ寡聚體的吞噬清除水平及蛋白印跡法檢測細胞上清液中未被小膠質細胞吞噬的Aβ寡聚體水平。實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。結果(1)AD細胞模型建立及siRNA處理:不同濃度的Aβ寡聚體對小膠質細胞的毒性作用呈現(xiàn)劑量-效應關系。自0.5 μmol/L濃度起,寡聚體的毒性作用明顯,濃度為1.0 μmol/L時,BV2細胞的存活率下降約50%,所以選擇1.0 μmol/L濃度的Aβ寡聚體處理BV2細胞。采用siRNA方法沉默STAT3后結果顯示,與對照組比較,p-STAT3與總STAT3的mRNA及蛋白表達水平均明顯降低,表明該方法成功沉默BV2細胞中STAT3表達。(2)Aβ寡聚體對STAT3蛋白的影響:與正常對照組相比,1.0 μmol/L及以上濃度的Aβ寡聚體處理BV2細胞可使p-STAT3蛋白表達水平明顯增高;1.0 μmol/L Aβ寡聚體刺激BV2細胞的時間不同p-STAT3蛋白表達水平增高的程度也不同,其中處理4 h時STAT3磷酸化的水平較其他時間略高;而總STAT3蛋白表達水平沒有明顯改變。(3)小膠質細胞中IL1-β和TNF-α的表達:siRNA沉默STAT3后,小膠質細胞中IL1-β和TNF-α的mRNA及蛋白的表達水平較對照組相比均顯著增高;而siRNA沉默STAT3后再用Aβ寡聚體處理(即siSTAT3+Aβ組)與單純Aβ處理組相比,IL1-β和TNF-α的mRNA及蛋白的表達水平均明顯降低。(4)小膠質細胞中氧化應激水平的變化:Aβ處理組小膠質細胞中ROS、NO和MDA含量均顯著增加、SOD活性顯著降低;與Aβ處理組相比,siSTAT3+Aβ組細胞ROS、NO和MDA含量顯著減少,SOD活性顯著增高。(5)小膠質細胞凋亡率:Aβ處理組與正常對照組相比,小膠質細胞凋亡率顯著增加;siSTAT3+Aβ組與單純Aβ處理組相比,細胞凋亡率明顯降低,細胞凋亡率由(29.67± 2.53)%降為(15.28 ±1.69)%。(6)小膠質細胞對Aβ寡聚體的吞噬清除:與單純Aβ3處理組相比,siSTAT3+Aβ組BV2小膠質細胞對Aβ寡聚體的吞噬清除明顯增加,所收集的細胞上清液中,殘留的Aβ寡聚體顯著減少。結論:(1)Aβ寡聚體對小膠質細胞有明顯的神經毒性作用,可誘導小膠質細胞產生較強的炎癥反應及促進氧化應激水平。(2)Aβ寡聚體可引起小膠質細胞中STAT3活化。(3)siRNA沉默BV2小膠質細胞中STAT3的表達后,可減弱Aβ寡聚體引起的小膠質細胞的炎癥反應與氧化應激水平;(4)siRNA沉默BV2小膠質細胞中STAT3的表達后,可降低Aβ寡聚體引起的小膠質細胞凋亡并且促進小膠質細胞對Aβ寡聚體的清除。綜上所述,STAT3可能參與調控Aβ誘導的小膠質細胞的炎癥反應、氧化應激及細胞凋亡病理過程中的作用機制。
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【學位授予單位】：貴州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R749.16

【參考文獻】

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2 馮昱;李蕾;孫曉紅;;單核細胞和阿爾茨海默病(英文)[J];Neuroscience Bulletin;2011年02期

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本文編號：2443169