【摘要】：目的利用重度慢性牙周炎患牙分離培養(yǎng)炎癥牙髓間充質(zhì)細(xì)胞;健康牙齒分離培養(yǎng)的牙髓間充質(zhì)細(xì)胞作為對照組。體外進(jìn)行MTT檢測、與Bio-Oss骨粉復(fù)合培養(yǎng)、細(xì)胞膜片的制備、成骨誘導(dǎo)等相關(guān)檢測,以對重度慢性牙周炎患牙牙髓中牙髓間充質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性初步研究。方法在臨床收集重度慢性牙周炎患者因牙周破壞嚴(yán)重需要拔除的松動牙齒,同時收集臨床患者需要拔除的健康阻生智齒作為對照組,利用組織塊法體外分離培養(yǎng)牙髓間充質(zhì)細(xì)胞。待原代細(xì)胞培養(yǎng)成功后利用胰酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng),P3-P4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)室研究。在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入系列濃度的維生素C(0,10,20,40μg/ml),利用MTT法檢測其對細(xì)胞增殖的影響;將牙髓間充質(zhì)細(xì)胞制備成1×10~6/ml的細(xì)胞懸液,細(xì)胞體外將牙髓間充質(zhì)細(xì)胞與Bio-Oss骨粉復(fù)合培養(yǎng),利用掃描電鏡檢測細(xì)胞與骨粉生物復(fù)合情況;利用MTT檢測結(jié)果選擇最適濃度的Vc體外誘導(dǎo)細(xì)胞膜片的形成,掃描電鏡及HE染色檢測細(xì)胞膜片組織情況;在體外對牙髓間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo),通過茜素紅染色、ALP活性檢測及q PCR檢測重度慢性牙周炎對患牙牙髓組織中炎性因子和骨代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果共收集25名重度慢性牙周炎患者拔除的患牙47顆,體外進(jìn)行牙髓間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)成功率為34/47(72%);對照組共收集3位患者因阻生需要拔除的健康智齒進(jìn)行牙髓間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)成功率為100%。牙周炎組和健康組的原代細(xì)胞從組織塊爬出的時間分別為7-14天和3-5天。MTT檢測提示兩組細(xì)胞增殖能力無明顯區(qū)別,Vc對于牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的增殖影響具有濃度依耐性,當(dāng)Vc濃度為20μg/ml時可明顯促進(jìn)細(xì)胞的增殖(P0.05),但是當(dāng)Vc濃度增加到40μg/ml時,可明顯抑制細(xì)胞的增殖(P0.05)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到近融合后,利用20μg/ml的Vc對細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)2-3周后,兩組細(xì)胞均可形成完整的細(xì)胞膜片。對兩組細(xì)胞膜片倒置顯微鏡下觀察、HE染色檢測、掃描電鏡檢測可見細(xì)胞復(fù)層生長,細(xì)胞間緊密連接,有大量細(xì)胞間質(zhì)保留,兩組細(xì)胞膜片的鏡下形態(tài)無明顯區(qū)別。體外將細(xì)胞與骨粉復(fù)合培養(yǎng)一周后形成生物復(fù)合物,掃描電鏡檢測可見兩組細(xì)胞均可以黏附生長于骨粉上,形態(tài)良好。對兩組細(xì)胞進(jìn)行體外成骨誘導(dǎo),茜素紅染色提示均可見明顯的成骨結(jié)節(jié);ALP活性檢測提示其隨著成骨誘導(dǎo)時間增加,其ALP活性增強(qiáng)。q-PCR檢測兩組細(xì)胞炎性因子和骨代謝相關(guān)基因提示:相對于健康牙髓間充質(zhì)細(xì)胞,牙周炎組牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的IL-1β,IL-6,IL-8,和TNF-α的m RNA相對表達(dá)量明顯較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。經(jīng)成骨誘導(dǎo)后,兩組細(xì)胞的成骨相關(guān)基因(ALP,OCN,BMP2,RUNX2)均出現(xiàn)明顯上調(diào)(P0.05),組間比較發(fā)現(xiàn),相對于健康牙髓間充質(zhì)細(xì)胞,炎癥牙髓間充質(zhì)細(xì)胞的成骨基因表達(dá)較低(P0.05)。結(jié)論因重度慢性牙周炎致牙周破壞嚴(yán)重?zé)o法保留的患牙,在體外依然可以分離培養(yǎng)出牙髓間充質(zhì)細(xì)胞,且其與正常牙髓間充質(zhì)細(xì)胞具有相似的增殖能力及形成細(xì)胞膜片能力;經(jīng)與骨粉復(fù)合培養(yǎng)后能在骨粉上粘附生長;體外成骨誘導(dǎo)后,可形成明顯的成骨結(jié)節(jié),但與正常牙髓間充質(zhì)細(xì)胞相比,其成骨能力較低。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R781.42

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2367339