本文選題：氣道上皮細(xì)胞系A(chǔ)549 + Rac1�。� 參考：《江蘇大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:哮喘時(shí)大量上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡且難以清除可能是構(gòu)成氣道高反應(yīng)性的潛在因素。本論文以氣道上皮細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對象,分析Rac1的表達(dá)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系和對凋亡細(xì)胞吞噬功能的影響,借此探討哮喘患者氣道高壓形成的因素和可能機(jī)制,也為控制哮喘尋找新的、可能的干預(yù)靶點(diǎn)。方法:1.A549細(xì)胞的培養(yǎng):將氣道上皮細(xì)胞系A(chǔ)549用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)用于相關(guān)試驗(yàn)。細(xì)胞凍存則按常規(guī)方法進(jìn)行。2.選擇姜黃素為凋亡誘導(dǎo)物,誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞A549的凋亡。分別以30μmol/L、50μmol/L、70μmol/L濃度的姜黃素刺激細(xì)胞12小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí),分析上述條件下A549的凋亡情況。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:采用AnnexinV和PI雙染的方法,依照試劑盒使用說明書,染色凋亡的A549細(xì)胞,并于4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞的檢測分析,觀察細(xì)胞的凋亡情況。4.Hoechst核染色觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài):Hoechst核染液在細(xì)胞凋亡后依照具體標(biāo)準(zhǔn)操作流程染凋亡細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和核形態(tài),以直觀A549細(xì)胞的凋亡情況。5.A549細(xì)胞吞噬試驗(yàn):選取狀態(tài)良好的A549細(xì)胞,以每孔4x105個(gè)細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板,5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜。待細(xì)胞生長密度至50%-60%時(shí),收集已誘導(dǎo)48小時(shí)的凋亡細(xì)胞。重懸后PI染色5min,PBS洗兩遍。將處理后的凋亡細(xì)胞以2倍于正常細(xì)胞的量加入六孔培養(yǎng)板中,37℃恒溫共培養(yǎng)90min后進(jìn)行流式分析和熒光定量PCR的檢測。6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR):在進(jìn)行A549細(xì)胞的吞噬試驗(yàn)后,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定IL-33和Rac1的mRNA表達(dá)水平。7.Rac1抑制劑(NSC23766)抑制吞噬試驗(yàn):在吞噬試驗(yàn)進(jìn)行的24小時(shí)前,將Rac1抑制劑NSC23766依照50μmol/L,100μmol/L的濃度分別加入培養(yǎng)體系。24小時(shí)后棄上清換全新培養(yǎng)液,繼續(xù)依照吞噬實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行吞噬試驗(yàn)。結(jié)果：1.姜黃素可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡:將姜黃素以50μmol/L的濃度刺激A549細(xì)胞24小時(shí),約有五成的細(xì)胞發(fā)生凋亡,其中20%左右為晚凋;而當(dāng)時(shí)間條件為48小時(shí)時(shí),90%的細(xì)胞發(fā)生了凋亡。2.Rac1抑制劑(NSC23766)可以增強(qiáng)姜黃素引起的凋亡效應(yīng):在姜黃素的凋亡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中加入Rac1抑制劑,可以使A549的凋亡效應(yīng)顯著增強(qiáng),并且隨著抑制劑濃度的增加,這種增強(qiáng)的效應(yīng)更加明顯,呈劑量依賴性。3.氣道上皮細(xì)胞A549具有吞噬能力:吞噬試驗(yàn)后的流式檢測結(jié)果顯示,生長狀態(tài)良好的未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)的A549細(xì)胞能夠吞噬凋亡細(xì)胞,表明A549細(xì)胞具有良好的吞噬能力。4.吞噬過程中IL-33表達(dá)水平增高:吞噬試驗(yàn)后將參與吞噬作用的A549細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),IL-33的mRNA水平明顯增高,但Rac1的表達(dá)水平?jīng)]有變化。5.Rac1抑制劑(NSC23766)可以抑制A549細(xì)胞的吞噬功能:吞噬試驗(yàn)中加入抑制劑后能夠發(fā)現(xiàn),A549細(xì)胞的吞噬能力下降。結(jié)論:姜黃素能夠有效地誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡。Rac1抑制劑的作用表明在凋亡過程中,Rac1的表達(dá)對上皮細(xì)胞凋亡起著負(fù)向調(diào)節(jié)作用,而對上皮細(xì)胞的吞噬功能則有明顯的促進(jìn)效應(yīng)。
[Abstract]:Objective : To investigate the apoptosis of A549 cells . The apoptosis of A549 cells was investigated by means of real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) .
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R562.25

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本文編號：1929986