本文選題：腦缺血再灌注損傷　切入點：TIPE2　出處：《山東大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:缺血性腦血管疾病嚴重威脅人類健康、影響生活質量,并有逐年遞增的趨勢,是現代社會致死、致殘的最主要的疾病之一,已經成為嚴重影響老年人健康的常見疾病。但由于其發(fā)病機制尚不清楚,對其防治帶來困難。臨床和動物實驗表明血管再通后的再灌注損傷(Ischemia-Reperfusion Injury,IRI)在缺血性腦血管疾病的進程中發(fā)揮關鍵作用,多種因素參與到了這個過程。炎癥反應在腦缺血再灌注中的作用受到了越來越多的關注,適度的炎癥反應可以清除壞死的組織,但過強的炎癥反應可引起腦組織的進一步損傷。因此,深入研究腦缺血再灌注損傷過程中的免疫調控機制,找到免疫調節(jié)信號通路中的關鍵信號分子,將為預防及治療缺血性腦損傷提供新的靶點,具有重要的理論意義和臨床應用價值。腫瘤壞死因子α誘導蛋白8樣分子2(TumorNecrosis Factor-α-Induced Protein 8-Like2,TIPE2/TNFAIP8L2)是于2008年發(fā)現并鑒定的新基因,屬于TNFAIP8家族,研究表明TIPE2參與多種腫瘤及炎癥相關疾病的發(fā)生發(fā)展過程,其主要功能是抑制炎癥和誘導凋亡。課題組前期結果明確了 TIPE2通過抑制炎癥細胞的浸潤和炎癥因子的產生,在腦缺血再灌注損傷中起到免疫負調控及保護作用,因此TIPE2有望成為缺血性腦血管疾病治療的新靶點,但目前對TIPE2在腦缺血再灌注炎癥中發(fā)揮免疫負調控作用的具體機制尚不清楚。內質網是細胞內蛋白修飾的重要場所,當細胞受到缺血、氧化應激等刺激時,啟動未折疊蛋白反應(Unfolded Protein Response,UPR),其首要目標是清除應激狀態(tài)下產生的大量未折疊蛋白,恢復細胞穩(wěn)態(tài);但強烈持久的刺激會引起內質網應激(Endoplasmic Reticulum Stress,ER Stress),UPR就會啟動細胞死亡程序,損傷細胞和組織。內質網應激參與到腫瘤、腦中風和阿爾茨海默病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中。近年來研究發(fā)現,內質網應激在機體的炎癥反應中發(fā)揮重要作用,TIPE2是否通過調控ER Stress參與到腦缺血再灌注炎癥目前尚未見報道。腦缺血再灌注引起內質網應激一方面通過改變細胞的轉錄和翻譯清除過多的未折疊蛋白恢復細胞穩(wěn)態(tài),另一方面持續(xù)的內質網應激也是引起炎癥反應的重要原因,但其具體的分子機制尚不清楚。腦缺血再灌注炎癥反應是典型的非感染性炎癥反應,固有免疫與適應性免疫參與了炎癥的發(fā)生發(fā)展。固有免疫在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用,通過模式識別受體(PRR)來識別病病原相關分子模式(PAMP)或者損傷相關分子模式(DAMP)。NOD樣受體(NLR)是一類細胞內感應PRR,NLRP3炎癥小體作為固有免疫的重要組分在機體免疫反應和疾病發(fā)生過程中具有重要作用,課題組前期研究表明其在腦缺血再灌注炎癥中發(fā)揮重要作用。ER Stress是否通過調控NLRP3參與到腦缺血再灌注炎癥反應目前尚未見報道,課題將對TIPE2調控ER Stress進而影響腦缺血再灌注炎癥的機制進行初步探索。本課題擬通過大腦中動脈栓塞模型(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)和細胞糖氧剝奪模型(Oxygen and Glucose Deprivation,OGD)從體內動物實驗和體外細胞實驗兩方面初步探索TIPE2在缺血再灌注炎癥損傷中的作用機制,找到參與CIR損傷的關鍵靶點,用于缺血性腦血管病的治療。方法:1.體外驗證TIPE2對炎癥因子的表達調控小膠質細胞是腦內重要的免疫細胞,約占腦內固有細胞的10%-15%,在腦缺血再灌注炎癥中發(fā)揮重要作用,課題組前期研究結果表明TIPE2主要表達在小膠質細胞。因此體外實驗我們選用小膠質細胞系BV-2進行OGD模擬體內缺血再灌注模型。1.1 通過實時定量RT-PCR、Western blot檢測OGD2h再灌注3h、6h、12h、24h后TIPE2的mRNA及蛋白表達變化。1.2通過實時定量RT-PCR檢測OGD2h再灌注12h后細胞因子TNF-α,IL-lβ,IL-6,IL-18及趨化因子MCP-1的表達變化。1.3 BV-2細胞體外轉染pRK5-TIPE2質粒24h后進行OGD處理,應用實時定量RT-PCR的方法檢測炎癥因子的表達變化。2.TIPE2通過抑制ER Stress調控腦缺血再灌注炎癥反應2.1通過體內實驗,初步探討TIPE2對Bip表達變化的影響:8-10周齡TIPE2-/-鼠建立MCAO腦缺血再灌注損傷模型,通過免疫熒光雙標(小膠質細胞標志蛋白CD1 lb和內質網應激活化蛋白Bip雙標)及Western blot檢測Bip的表達變化,初步探討TIPE2在腦缺血再灌注損傷中對內質網應激的影響。2.2體外驗證TIPE2對Bip的調控:在BV-2細胞中,應用siTIPE2抑制TIPE2表達或應用PRK5-TIPE2質粒過表達TIPE2,Western blot檢測Bip的表達變化;同時檢測在體外OGD及ER stress激動劑(5mM)、抑制劑4-PBA(10mM)作用下,TIPE2對Bip的表達調控,進一步體外驗證TIPE2對Bip的調控。2.3 TIPE2通過ER Stress調控炎癥因子的表達:在BV-2細胞中轉染PRK5-TIPE2質粒過表達TIPE2,加入內質網應激激動劑TG(5mM)12h小時后RT-PCR以及CBA檢測炎癥因子的表達;同時BV-2細胞應用siTIPE2抑制TIPE2表達,ER Stress抑制劑4-PBA(10mM)刺激12h后RT-PCR、CBA檢測炎癥因子的表達。2.4 TIPE2對ER Stress下游通路的調控:在BV-2細胞中,用pRK5-TIPE2質粒過表達TIPE2,OGD2h再灌注12h后Western blot檢測ER Stress三條信號通路:PERK,IRE1及ATF6的變化。2.5在體內MCAO模型中,驗證TIPE2對ER Stress的調控:8-10周齡TIPE2-/-小鼠及WT型小鼠MCAO模型前24h腹腔注射ER Stress抑制劑4-PBA 2次,100mg/kg/次,預處理后建立MCAO局部缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h后通過HE、尼氏以及TUNEL染色觀察實驗組小鼠皮層和海馬損傷的情況,用CBA檢測上述模型小鼠血清中炎癥因子的表達變化,Western blot檢測小鼠腦組織勻漿中Bip以及內質網應激相關蛋白的表達變化。3.初步探索ER Stress調控腦缺血再灌注炎癥的機制3.1 ER Stress對炎癥的調控及機制探索:體內實驗,8-10周齡C57BL/6J小鼠腹腔注射ER Stress抑制劑4-PBA后建立MCAO局部缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h后通過Western blot檢測Bip,NLRP3的表達變化。體外實驗:應用ERStress抑制劑4-PBA(10mM)處理BV-2細胞后進行OGD再灌注實驗,通過Western blot檢測Bip,NLRP3的表達變化,實時定量RT-PCR檢測炎癥因子mRNA水平的表達變化。3.2 TIPE2負調控NLRP3的表達:BV-2細胞中轉染pRK5-TIPE2質粒過表達TIPE2,Western blot檢測TIPE2、NLRP3的表達變化,細胞免疫熒光雙標共聚焦觀察TIPE2及NLRP3在小膠質細胞內的表達、共定位情況。結果:1.在體外實驗中,TIPE2抑制炎癥因子的表達1.1 BV-2細胞OGD2h再灌注不同時間點后,實時定量RT-PCR、Western blot結果顯示TIPE2 mRNA及蛋白水平在再灌注6h、12h有顯著性-降低。1.2 BV-2細胞OGD2h再灌注12h后實時定量RT-PCR結果顯示,與對照組相比各細胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-18及趨化因子MCP-1的表達均有顯著升高。1.3 BV-2細胞體外轉染pRK5-TIPE2質粒24h后進行OGD處理,實時定量RT-PCR結果顯示,與對照組相比OGD再灌注后各細胞因子的表達均有顯著升高,而過表達TIPE2可顯著抑制再灌注后炎癥因子的表達升高。這些實驗結果提示,TIPE2負性調控腦缺血再灌注炎癥因子的表達。2 TIPE2通過抑制ER Stress調控腦缺血再灌注炎癥反應2.1體內結果顯示TIPE2抑制Bip表達:TIPE2-/-小鼠建立MCAO腦缺血再灌注損傷模型,通過免疫熒光雙標(小膠質細胞標志蛋白CD l1b和內質網應激活化蛋白Bip雙標)發(fā)現在缺血2h再灌注24h后,小膠質細胞的數量以及Bip的表達量均明顯增多,與野生型小鼠相比TIPE2-/-敲基因鼠腦缺血再灌注后小膠質細胞進一步增多,Bip的表達升高。Western blot結果也顯示,與假手術組相比Bip的表達增加;與WT組相比TIPE2-/-組中Bip的升高更明顯。這些結果初步表明,TIPE2可以抑制Bip的表達,TIPE2可能通過內質網應激調控腦缺血再灌注炎癥反應。2.2 TIPE2抑制Bip的表達:BV-2細胞干預TIPE2表達,Western blot結果顯示抑制TIPE2后Bip的表達明顯升高;而過表達TIPE2時Bip的表達顯著降低。過表達TIPE2可以抑制OGD引起的Bip升高:BV-2細胞過表達TIPE2,Western blot結果顯示與對照組細胞相比,OGD2h再灌注12h后Bip的蛋白水平升高明顯,過表達TIPE2可以抑制OGD引起的Bip表達水平的升高。過表達TIPE2可以抑制ER Stress激動劑TG引起的Bip升高:BV-2細胞過表達TIPE2,加入ER Stress激動劑TG刺激12h后Western blot結果顯示,Bip蛋白表達水平明顯升高,過表達TIPE2可抑制由ER Stress的激活而引起的Bip的升高。抑制TIPE2可上調Bip的表達:加入ER Stress抑制劑4-PBA處理后12h后Western blot結果顯示Bip的蛋白表達水平顯著降低,干擾TIPE2可上調Bip的表達。2.3 TIPE2抑制ER Stress引起的炎癥因子的表達升高:BV-2細胞中過表達TIPE2,加入內質網應激激動劑TG(5mM)12h小時后,RT-PCR及CBA結果顯示與對照組相比較,TG刺激組炎癥因子的表達顯著性升高,當過表達TIPE2后可以抑制由TG引起的炎癥因子高表達;同時BV-2細胞抑制TIPE2表達,ER Stress抑制劑4-PBA(10mM)刺激12h,RT-PCR及CBA結果顯示,與過表達結果一致,4-PBA處理可以抑制炎癥因子的表達,抑制TIPE2可以上調炎癥因子的表達。2.4 TIPE2抑制PERK及IRE1信號通路的激活:BV-2細胞過表達TIPE2,OGD2h再灌注12h后,Western blot結果顯示與對照組相比OGD后內質網應激通路中PERK、eIF2α、IRE1的磷酸化水平顯著上調,而ATF6無明顯變化;過表達TIPE2可顯著性抑制PERK、eIF2α、IRE1的磷酸化水平,這提示我TIPE2可以通過抑制PERK-eIF2α和IRE1信號通路對內質網應激進行調控。2.5體內實驗表明TIPE2抑制ER Stress:TIPE2-/-小鼠用ER Stress抑制劑4-PBA預處理建立MCAO局部缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h后,HE、尼氏染色及TUNEL染色觀察發(fā)現,缺血再灌注后皮層和海馬腦組織均有明顯的的損傷和凋亡。與WT組相比TIPE2-/-小鼠組損傷更為嚴重,4-PBA預處理組可以明顯改善TIPE2缺失引起的損傷。CBA結果顯示,與WT小鼠組相比TIPE2-/-小鼠組的炎癥因子表達明顯升高,4-PBA預處理組的炎癥因子表達與模型組相比均有一定程度的降低。Westem blot結果也顯示,與WT小鼠組相比,TIPE2-/-組中Bip及下游信號通路PERK及IRE1的磷酸化水平均顯著升高,4-PBA預處理后PERK以及IRE1的磷酸化水平與模型組相比均有一定程度的降低。3.ER Stress促進腦缺血再灌注損傷的機制3.1體內外結果提示ER Stress影響NLRP3的表達:小鼠腹腔注射ER Stress抑制劑4-PBA預處理后建立MCAO局灶性缺血再灌注模型,缺血2h再灌注24h,Western blot結果顯示與假手術組相比,缺血再灌注后Bip以及NLRP3的蛋白表達水平顯著性升高,ERstress抑制劑4-PBA可以抑制Bip及NLRP3的表達。體外結果進一步驗證ER Stress負性調控NLRP3的表達:抑制BV-2細胞中的TIPE2后加入4-PBA處理12h,Western blot結果顯示在OGD再灌注后Bip以及NLRP3表達升高,加入ER-stress抑制劑4-PBA抑制Bip及NLRP3的表達。體內外結果提示ER Stress促炎作用與調控NLRP3的表達密切相關。3.2在BV2細胞中,過表達TIPE2,Western blot及免疫熒光結果顯示TIPE2可以明顯抑制NLRP3的表達;OGD后可觀察到TIPE2的表達降低,NLRP3表達升高;過表達TIPE2質�？梢砸种朴蒓GD引起的NLRP3表達的升高,且TIPE2與NLRP3共定位于細胞漿內。結論:1.TIPE2可以通過抑制內質網應激調控腦缺血再灌注炎癥反應。2.內質網應激可以部分通過調控NLRP3促進腦缺血再灌注炎癥。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R743.3

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本文編號：1702806