本文選題：骨髓間充質干細胞　切入點：周期性牽張力　出處：《山東大學》2017年碩士論文

【摘要】：背景正畸牙移動、牽張成骨和縫牽張技術的共同生物學基礎是應力刺激對骨改建和骨塑建的調控作用。作為當前骨組織工程領域的首選研究對象,骨髓間充質干細胞(BMSCs)對機械刺激反應敏感,是力學作用下骨骼改建的細胞學基礎之 。生理條件下,適當力值的機械刺激能促使BMSCs成骨分化。miRNAs(microRNAs)是非編碼小RNA,它是內源性的,并具有功能調控作用。成熟的miRNAs可通過堿基互補配對的形式識別靶基因mRNA,并對其進行降解或者阻遏其翻譯過程,從而發(fā)揮生物學功能。研究發(fā)現(xiàn),miRNA能夠調控生物體的很多重要生命活動,包括組織器官的發(fā)育、細胞的增殖、分化和凋亡以及防御病毒侵襲、促進物質代謝等等。大量miRNAs已被證實對于機械力敏感,且部分應力敏感的miRNAs能夠在機械力所致的BMSCs的成骨分化過程中發(fā)揮功能調節(jié)作用。miR-503-5p,作為本課題組前期基因芯片篩選出的差異表達顯著的miRNA,其抑制牽張應力誘導的rBMSCs成骨向分化的功能已經(jīng)在體內外實驗中得到驗證。然而,miR-503-5p是如何抑制rBMSCs的成骨分化,其具體的分子調控機制又是怎樣的,目前仍不清楚。目的在前期成果miR-503-5p在應力誘導rBMSCs成骨分化中起著重要的負性調控作用的基礎上,繼續(xù)從細胞分子生物學角度入手,利用生物信息學方法預測其可能的靶基因并篩選驗證,進一步深入探討miR-503-5p在力環(huán)境下調控成骨分化的分子作用機制,為臨床正畸力作用下的骨改建和牙移動提供實驗依據(jù)和理論基礎。方法(1)rBMSCs的獲取、培養(yǎng)及干性鑒定,為最適條件下的周期性張應力加載做細胞儲備。(2)生物信息學預測:利用miRNA靶基因預測軟件如TargetScan、miRwalk等,結合DAVID工具網(wǎng)站、GO富集分析、KEGG-Pathway及相關文獻,篩選miR-503-5p可能參與調控的靶基因。(3)雙熒光素酶報告基因、qRT-PCR和Western blot共同檢測擬研究基因是否為miR-503-5p的靶標基因。(4)siRNA靶向沉默該靶標基因,Western blot分別檢測該靶基因及成骨相關因子ALP、BSP、CollgenI、Runx2等蛋白水平表達變化,對靶基因的功能進行驗證。結果(1)成功分離培養(yǎng)rBMSCs,流式細胞術鑒定P4代rBMSCs特征表型,結果可見:CD44、CD90(+),CD34、CD45(-),細胞符合實驗要求。成骨誘導28后茜素紅染色可見鈣結節(jié)生成,成脂誘導28天后油紅O染色可見脂滴形成。(2)miR-503-5p 靶向作用于 Hoxa2、BCL2、IGF2、ACVR2A、SMAD1、BMPR1A等的可能性較大,綜合分析擬進一步研究BMPR1A。(3)與非加力組相比,加力組細胞BMPR1A的mRNA及蛋白表達水平上調,且螢火蟲和海腎熒光素酶活性的比值顯著升高(P0.05)。(4)rBMSCs 分別瞬時轉染 miR-503-5p mimic/inhibitor 及 miR-503-5p mimic-NC/inhibitor-NC后檢測,mimic組BMPR1A的mRNA及蛋白表達水平較NC組降低(P0.01),而inhibitor組BMPR1A的mRNA及蛋白表達水平較NC組升高(P0.01)。(5)雙熒光素酶報告基因結果顯示,共轉染pmiR-RB-ReportTM-BMPRIA-3'UTR和miR-503-5p mimics組螢火蟲和海腎熒光素酶活性的比值顯著低于mimic-NC組(P0.01);與之相反,共轉染 pmiR-RB-ReportTM-BMPR1A-3'UTR 和miR-503-5p inhibitor組螢火蟲和海腎熒光素酶活性的比值顯著升高于inhibitor-NC組(P0.01),差異具有統(tǒng)計學意義。(6)與 NC 組相比,SiRNA-BMPR1A 沉默組細胞的 BMPR1A 及 ALP、Runx2、BSP、CollgenⅠ蛋白水平表達下降。結論(1)BMPR1A 是 miR-503-5p 的靶基因。(2)周期性牽張力對rBMSCs成骨向分化的抑制作用是通過miR-503-5p靶向調控BMPR1A實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R781

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本文編號：1671858