本文關(guān)鍵詞： GPR84 敗血癥 炎癥反應(yīng) 巨噬細(xì)胞　出處：《華東師范大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：敗血癥是一種全身性的炎癥反應(yīng),其發(fā)病率和死亡率都比較高。目前對(duì)敗血癥的治療主要采用抗菌治療,但因?yàn)橛袝r(shí)不能準(zhǔn)確地診斷出致病菌,所以該治療手段存在一定的局限性。利用抗炎性藥物實(shí)行的免疫治療能夠阻斷敗血癥患者的劇烈炎癥反應(yīng),被認(rèn)為是有效的治療手段。然而,由于對(duì)敗血癥的長(zhǎng)期性炎癥反應(yīng)及其調(diào)控機(jī)制缺乏有效的研究,這種免疫治療手段還沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的治療效果。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索發(fā)現(xiàn),在敗血癥感染性休克兒童的血液樣本中,GPR84呈現(xiàn)出高表達(dá),這提示GPR84可能在敗血癥這一疾病中發(fā)揮了一定的調(diào)控作用。游離脂肪酸受體GPR84(G-protein coupled receptor 84)是游離脂肪酸受體家族的成員,并含有7次跨膜蛋白結(jié)構(gòu),也是一種G蛋白偶聯(lián)受體。研究發(fā)現(xiàn),Gpr84參與促進(jìn)炎癥反應(yīng),并且通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。在小鼠中,Gpr84在LPS刺激的骨髓巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。在RAW264.7細(xì)胞中,Gpr84的激活劑能夠通過(guò)激活Gpr84增強(qiáng)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的IL-12βp40的表達(dá)。為研究Gpr84是否參與調(diào)控?cái)⊙Y這一疾病,本論文進(jìn)行了以下的實(shí)驗(yàn)研究:在本實(shí)驗(yàn)前期研究中,利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Gpr84敲除小鼠,通過(guò)對(duì)小鼠基因進(jìn)行DNA測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)敲除小鼠的Gpr84基因的一個(gè)外顯子中共敲除172bp長(zhǎng)度的堿基序列。對(duì)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞的Gpr84的mRNA和蛋白的表達(dá)量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在Gpr84-/-小鼠的骨髓巨噬細(xì)胞中Gpr84均不表達(dá)。因而Gpr84敲除小鼠構(gòu)建成功,為后續(xù)從體外細(xì)胞水平和體內(nèi)水平研究Gpr84對(duì)敗血癥的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)腹腔注射LPS構(gòu)建小鼠敗血癥模型,從機(jī)體水平研究Gpr84對(duì)敗血癥的調(diào)控作用。結(jié)果顯示,Gpr84敲除的敗血癥小鼠存活率明顯高于野生型敗血癥小鼠。Gpr84敲除后,敗血癥小鼠的血清中TNF-α、IL-6和IL-12βp40的表達(dá)明顯低于野生型小鼠。在敗血癥模型中,Gpr84敲除小鼠的腹腔液中IL-6和IL-12βp40的表達(dá)量也低于野生型小鼠。隨后從野生小鼠和Gpr84敲除小鼠體內(nèi)提取骨髓細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為骨髓巨噬細(xì)胞以及提取腹腔巨噬細(xì)胞,進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。利用RT-PCR和Q-PCR等方法分析了游離脂肪酸受體Gpr84在小鼠骨髓巨噬細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞受到LPS刺激時(shí),與游離脂肪酸受體家族其它受體相比,Gpr84呈高表達(dá),這一結(jié)果與Wang J等人的研究結(jié)果相一致。接著檢測(cè)在LPS刺激條件下,Gpr84在巨噬細(xì)胞中發(fā)揮的調(diào)控作用,以及通過(guò)巨噬細(xì)胞對(duì)炎癥的調(diào)控作用。結(jié)果顯示,與野生小鼠相比,Gpr84敲除小鼠來(lái)源的骨髓巨噬細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞,在受到LPS刺激時(shí),細(xì)胞中促炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-12αp35和IL-12βp40的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量降低。Gpr84敲除后,骨髓巨噬細(xì)胞受LPS刺激后其吞噬細(xì)菌能力下降。Gpr84對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬細(xì)菌的能力沒(méi)有顯著性影響。Gpr84敲除與否不影響LPS刺激時(shí)巨噬細(xì)胞中趨化因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá),也不影響LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移能力。綜上所述,Gpr84能夠參與促進(jìn)炎癥反應(yīng),主要通過(guò)增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中促炎癥應(yīng)子如TNF-α、IL-6和IL-12βp40的轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而加劇炎癥反應(yīng)。Gpr84敲除后能降低敗血癥小鼠血清中促炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-12βp40及腹腔液中IL-6和IL-12β p40的表達(dá)量,減輕小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng),提高敗血癥小鼠存活率。本論文為研究以Gpr84作為可能的藥物靶點(diǎn)提供新的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Gpr84 ( Gpr84 ) is a member of free fatty acid receptor family . In conclusion , Gpr84 could reduce the expression of TNF - 偽 , IL - 6 and IL - 12尾p40 in peritoneal fluid . Gpr84 could reduce the expression of TNF - 偽 , IL - 6 and IL - 12尾p40 in macrophages .

【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R515.3;R-332

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