本文關(guān)鍵詞：外泌體介導(dǎo)的miR-222及其衍生物在乳腺癌耐藥中的研究　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:乳腺癌化療耐藥是乳腺癌(尤其晚期乳腺癌)患者治療失敗最常見(jiàn)和最難克服的問(wèn)題之一,也是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)miR-222能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性,同時(shí)miR-222水平在阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株(MCF/ADR)的外泌體中明顯升高,但是其通過(guò)外泌體傳遞耐藥的機(jī)制并未完全闡明。因此,本課題通過(guò)裝載miR-222的衍生物(mimic/inhibitor)進(jìn)入外泌體,建立特殊的外泌體-mimic/inhibitor復(fù)合體模型,探討外泌體中miR-222對(duì)乳腺癌耐藥的作用及其潛在機(jī)制。方法:1、以MCF/7細(xì)胞系構(gòu)建出的耐藥株MCF-7/ADR和同步非加藥培養(yǎng)的敏感株MCF-7/S為研究對(duì)象。免疫熒光驗(yàn)證耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞的P糖蛋白和TSG101蛋白的表達(dá)水平,同時(shí)蛋白定量精確測(cè)定耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞分泌的外泌體量差。2、使用共聚焦顯微觀察攝取不同量(50μg、100μg、200μg)耐藥細(xì)胞外泌體(A-exos)的敏感細(xì)胞;qRT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-222的水平;用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組經(jīng)外泌體處理后的細(xì)胞與阿霉素共培養(yǎng)后的凋亡率。3、建立電轉(zhuǎn)方程,以最佳條件將miR-222 mimic導(dǎo)入HBL-100外泌體(mimic-exos);研究mimic-exos對(duì)敏感細(xì)胞耐藥性的影響。4、通過(guò)電轉(zhuǎn)染將miR-222 inhibitor導(dǎo)入外泌體(inhibitor-exos),耐藥細(xì)胞與inhibitor-exos共培養(yǎng)后,檢測(cè)各組細(xì)胞miR-222和PTEN的表達(dá)變化以及相應(yīng)細(xì)胞耐藥性的變化;Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PTEN的蛋白表達(dá)。5、通過(guò)比較腫瘤的生長(zhǎng)曲線,在荷瘤小鼠體內(nèi)驗(yàn)證瘤內(nèi)注射inhibitor-exos對(duì)腫瘤耐藥細(xì)胞的作用,并檢測(cè)腫瘤組織以及小鼠血清外泌體中miR-222和PTEN的表達(dá)變化。6、在新輔助化療后的乳腺癌患者腫瘤標(biāo)本中通過(guò)免疫組化染色方法驗(yàn)證了PTEN及外泌體標(biāo)記蛋白TSG101的表達(dá)。結(jié)果:1.耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞P糖蛋白和TSG101蛋白的表達(dá)明顯上調(diào);相同體積的細(xì)胞上清中,耐藥株MCF-7/ADR分泌的外泌體(A-exos)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于敏感株MCF-7/S所分泌的外泌體(S-exos)。2.加入的外泌體量越多,細(xì)胞攝取的量也越多;攝取了更多外泌體(1000μg、200μg)的敏感細(xì)胞耐藥性要明顯高于攝取少量外泌體(5(μg)的敏感細(xì)胞;攝取了更多耐藥細(xì)胞外泌體的細(xì)胞中miR-222水平明顯高于其他組的細(xì)胞。3.最佳電轉(zhuǎn)染條件:50μg/100μL外泌體,轉(zhuǎn)染時(shí)電壓180V;成功構(gòu)建mimic-exos復(fù)合體,與敏感細(xì)胞共培養(yǎng)后可明顯增強(qiáng)其對(duì)阿霉素的耐藥性。4.加入inhibitor-exos共培養(yǎng)的耐藥細(xì)胞的對(duì)阿霉素的耐藥性減低,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率明顯增加;且伴隨細(xì)胞中miR-222水平下調(diào)和PTEN的表達(dá)增強(qiáng)。5.瘤內(nèi)注射inhibitor-exos的小鼠腫瘤大小明顯小于對(duì)照和空白組,腫瘤組織中的miR-222水平下調(diào),且靶基因PTEN的表達(dá)增強(qiáng)。6.檢測(cè)接受新輔助化療的乳腺癌患者腫瘤組織,發(fā)現(xiàn)PTEN在耐藥組中低表達(dá),外泌體標(biāo)記蛋白TSG101在耐藥組中高表達(dá)。結(jié)論:1.耐藥細(xì)胞比敏感細(xì)胞分泌更多的外泌體。2.耐藥細(xì)胞的外泌體能夠通過(guò)傳遞miR-222增強(qiáng)敏感細(xì)胞的耐藥性。3.構(gòu)建的mimic-exos復(fù)合體和inhibitor-exos復(fù)合體能夠模擬外泌體介導(dǎo)的miRNAs傳遞,影響耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性。4.瘤內(nèi)注射inhibitor-exos能夠在體內(nèi)減低腫瘤耐藥性,對(duì)耐藥腫瘤組織起一定的治療作用。5.證實(shí)外泌體確實(shí)參與乳腺癌患者腫瘤化療耐藥進(jìn)程,且外泌體通過(guò)調(diào)節(jié)miR-222/PTEN通路影響腫瘤細(xì)胞的耐藥性。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of miR - 222 and PTEN in breast cancer patients with breast cancer ( especially advanced breast cancer ) . The expression of miR - 222 in tumor tissues was downregulated , and the expression of PTEN was enhanced . 6 . It was found that the expression of PTEN in drug - resistant cells was lower than that of sensitive cells .

【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 張瑋;彭澎;沈鏗;;外泌體來(lái)源RNA在細(xì)胞通訊中的作用[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);2016年04期

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本文編號(hào)：1408119