本文關(guān)鍵詞：缺氧環(huán)境中長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTTIP促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:癌癥死亡的原因主要是癌癥被診斷時(shí)已經(jīng)處在中晚期,即使通過(guò)手術(shù),放療,化療或免疫治療后,腫瘤容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。肝癌在中國(guó)的發(fā)病率和死亡率就特別高,病因非常復(fù)雜,常見(jiàn)由是于HBV/HCV感染,黃曲霉素,酒精,肝硬化等原因。目前臨床上沒(méi)有特別好的治療手段,而且治療后容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展依賴(lài)于腫瘤的微環(huán)境,研究表明,缺氧微環(huán)境是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中最常見(jiàn)最重要的微環(huán)境之一,將腫瘤的代謝方式從三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒馔緩?通過(guò)HIF等重要的轉(zhuǎn)錄因子和其他重要基因激活相應(yīng)的通路,從而促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。肝癌在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在明顯的缺氧現(xiàn)象,特別是通過(guò)動(dòng)脈化療栓塞手術(shù)治療后,會(huì)出現(xiàn)非常明顯的缺氧情況,將會(huì)導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,臨床治療效果差。隨著二代測(cè)序技術(shù)大規(guī)模的應(yīng)用,大量的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn),包括:miRNA、lncRNA、circularRNA、snRNA等,研究發(fā)現(xiàn)這些非編碼RNA對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的作用。研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTTIP在肝癌臨床標(biāo)本中高表達(dá),與肝癌的轉(zhuǎn)移正相關(guān),與肝癌的預(yù)后負(fù)相關(guān),在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的功能,但其促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制尚不清楚。因此本研究主要集中在缺氧的微環(huán)境下,長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTTIP促進(jìn)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究。方法:1.探究缺氧環(huán)境下,缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α與長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTTIP之間的相互調(diào)節(jié)作用。向誘導(dǎo)罐充入低氧混合氣體(5%CO2,1%O2,94%N2),模擬腫瘤的缺氧微環(huán)境。敲低和過(guò)表達(dá)HIF-1α來(lái)研究HIF-1α對(duì)HOTTIP的調(diào)節(jié)作用;再采用熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來(lái)研究HIF-1α是否作為轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控HOTTIP的表達(dá)。反過(guò)來(lái)研究HOTTIP對(duì)HIF-1α調(diào)節(jié)作用及機(jī)制,研究?jī)烧呤欠裥纬烧答佌{(diào)節(jié)。2.探究缺氧環(huán)境下,長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTTIP對(duì)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響以及哪個(gè)分子介導(dǎo)此過(guò)程。缺氧誘導(dǎo)模型來(lái)研究肝癌細(xì)胞在缺氧微環(huán)境中,細(xì)胞形態(tài)的變化和EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)量的變化。肝癌細(xì)胞在正常培養(yǎng)和缺氧誘導(dǎo)下,敲低和過(guò)表達(dá)HOTTIP,研究HOTTIP對(duì)EMT相關(guān)標(biāo)志物mRNA和蛋白表達(dá)量的影響。同樣采用以上實(shí)驗(yàn),來(lái)研究哪個(gè)emt誘導(dǎo)因子介導(dǎo)了長(zhǎng)鏈非編碼rnahottip對(duì)emt標(biāo)志物的調(diào)節(jié)作用。3.探究長(zhǎng)鏈非編碼rnahottip對(duì)emt誘導(dǎo)因子調(diào)節(jié)的具體分子機(jī)制。生物信息學(xué)篩選出靶向的mirna。缺氧條件下,分別敲低和過(guò)表達(dá)hottip來(lái)研究mirna,emt誘導(dǎo)因子和emt標(biāo)志物之間的相關(guān)關(guān)系。在穩(wěn)定敲低hottip的細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染進(jìn)mirnainhibitor,研究對(duì)emt誘導(dǎo)因子表達(dá)量的影響;最后采用雙熒光報(bào)告基因的實(shí)驗(yàn),研究hottip和mirna的競(jìng)爭(zhēng)強(qiáng)弱對(duì)插入到熒光報(bào)告載體中的emt誘導(dǎo)因子的表達(dá)影響。敲低以及過(guò)表達(dá)hottip后,檢測(cè)wdr5蛋白的表達(dá)量變化;敲低或過(guò)表達(dá)wdr5后,檢測(cè)zeb1的mrna和蛋白表達(dá)變化;在穩(wěn)定敲低hottip組,再過(guò)表達(dá)wdr5,和對(duì)照組比較,檢測(cè)zeb1蛋白水平能否被恢復(fù)。結(jié)果:1.肝癌細(xì)胞缺氧培養(yǎng)后,長(zhǎng)鏈非編碼rnahottip的表達(dá)量明顯升高。用dfo過(guò)表達(dá)或sirna敲低hif-1α后,檢測(cè)到hottip的表達(dá)量升高或下降。hottip的啟動(dòng)子區(qū)包含hre的片段插入到pgl3熒光報(bào)告基因載體中,敲低或過(guò)表達(dá)hif-1α后,熒光活性明顯減弱或增強(qiáng),表明hif-1α作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)hottip的表達(dá)。正常培養(yǎng)和缺氧誘導(dǎo)下,敲低或過(guò)表達(dá)hottip,hif-1α蛋白表達(dá)量明顯下降或上升;敲低hif-1α后,再過(guò)表達(dá)hottip,檢測(cè)到hif-1α的蛋白水平能被恢復(fù)。在穩(wěn)定敲低hottip的細(xì)胞中,用chx阻斷蛋白質(zhì)翻譯,hif-1α在敲低組蛋白降解的速率明顯增強(qiáng);再用mg132來(lái)阻斷hif-1α降解的泛素蛋白酶體途徑,在敲低組hif-1α蛋白表達(dá)量也逐漸累積。2.缺氧誘導(dǎo)48h后,肝癌細(xì)胞形態(tài)變成明顯的長(zhǎng)梭型,利于細(xì)胞的遷移。emt標(biāo)志物n-cadherin、vimentin或e-cadherin的mrna水平和蛋白表達(dá)水平都明顯升高或下調(diào)。正常培養(yǎng)條件下,敲低和過(guò)表達(dá)hottip,emt標(biāo)志物n-cadherin、e-cadherin和vimentin,emt誘導(dǎo)因子snail1、snail2、zeb1、zeb2都沒(méi)有變化,然而在缺氧誘導(dǎo)的條件下,敲低或過(guò)表達(dá)hottip后,只有zeb1和e-cadherin的mrna和蛋白表達(dá)水平都明顯變化。3.預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)mirna-200a可能是潛在的靶基因,在缺氧條件下,敲低或過(guò)表hottip,mirna-200a表達(dá)上升或下降,zeb1表達(dá)下降或升高,e-cadherin表達(dá)升高或下降。在穩(wěn)定敲低hottip的細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,zeb1的表達(dá)下降,e-cadherin的表達(dá)明顯上升,但轉(zhuǎn)染進(jìn)了mirna-200a的inhibitor后,zeb1的表達(dá)明顯恢復(fù),最終E-cadherin的表達(dá)下降;HOTTIP與miRNA-200a結(jié)合的區(qū)域插到雙熒光報(bào)告基因載體psiCHECK-2,隨著miRNA-200a濃度的增加,熒光活性越來(lái)越弱;正常條件和缺氧誘導(dǎo)下,敲低或過(guò)表達(dá)HOTTIP發(fā)現(xiàn)WDR5蛋白表達(dá)量明顯下降或上升,肝癌細(xì)胞中敲低或過(guò)表達(dá)WDR5后,檢測(cè)到ZEB1的mRNA水平?jīng)]有變化,蛋白水平明顯下降或上升。在穩(wěn)定敲低HOTTIP組,WDR5蛋白表達(dá)水平下降,ZEB1蛋白水平下降,再過(guò)表達(dá)WDR5后,ZEB1蛋白水平被明顯恢復(fù)。結(jié)論:長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTTIP介導(dǎo)了肝癌細(xì)胞在缺氧微環(huán)境中發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的過(guò)程,通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活HOTTIP的高表達(dá),HOTTIP作為ceRNA吸附miRNA-200a,從而促進(jìn)ZEB1的表達(dá)以及HOTTIP能穩(wěn)定WDR5蛋白,同時(shí)促進(jìn)ZEB1蛋白的高表達(dá),進(jìn)而抑制E-cadherin的表達(dá),最終使肝癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:Objective : To study the effect of long - chain non - coding RNA HOTTIP on the expression of HOTTIP in hepatocellular carcinoma . The expression of hif - 1.alpha . protein was increased or decreased after hypoxia . Conclusion : Long - chain non - coding RNA HOTTIP ( HOTTIP ) plays an important role in inhibiting the expression of WDR5 protein .

【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R735.7

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1 許江兵;缺氧環(huán)境中長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTTIP促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：1408452