本文關(guān)鍵詞：缺氧環(huán)境中長鏈非編碼RNA HOTTIP促進肝癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機制研究　出處：《大連醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:癌癥死亡的原因主要是癌癥被診斷時已經(jīng)處在中晚期,即使通過手術(shù),放療,化療或免疫治療后,腫瘤容易復發(fā)和轉(zhuǎn)移。肝癌在中國的發(fā)病率和死亡率就特別高,病因非常復雜,常見由是于HBV/HCV感染,黃曲霉素,酒精,肝硬化等原因。目前臨床上沒有特別好的治療手段,而且治療后容易轉(zhuǎn)移和復發(fā)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展依賴于腫瘤的微環(huán)境,研究表明,缺氧微環(huán)境是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中最常見最重要的微環(huán)境之一,將腫瘤的代謝方式從三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒馔緩?通過HIF等重要的轉(zhuǎn)錄因子和其他重要基因激活相應的通路,從而促進腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。肝癌在發(fā)生發(fā)展過程中存在明顯的缺氧現(xiàn)象,特別是通過動脈化療栓塞手術(shù)治療后,會出現(xiàn)非常明顯的缺氧情況,將會導致腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移,臨床治療效果差。隨著二代測序技術(shù)大規(guī)模的應用,大量的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn),包括:miRNA、lncRNA、circularRNA、snRNA等,研究發(fā)現(xiàn)這些非編碼RNA對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要的作用。研究表明長鏈非編碼RNA HOTTIP在肝癌臨床標本中高表達,與肝癌的轉(zhuǎn)移正相關(guān),與肝癌的預后負相關(guān),在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的功能,但其促進腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機制尚不清楚。因此本研究主要集中在缺氧的微環(huán)境下,長鏈非編碼RNA HOTTIP促進肝癌細胞轉(zhuǎn)移的分子機制研究。方法:1.探究缺氧環(huán)境下,缺氧誘導因子HIF-1α與長鏈非編碼RNA HOTTIP之間的相互調(diào)節(jié)作用。向誘導罐充入低氧混合氣體(5%CO2,1%O2,94%N2),模擬腫瘤的缺氧微環(huán)境。敲低和過表達HIF-1α來研究HIF-1α對HOTTIP的調(diào)節(jié)作用;再采用熒光報告基因?qū)嶒瀬硌芯縃IF-1α是否作為轉(zhuǎn)錄因子通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控HOTTIP的表達。反過來研究HOTTIP對HIF-1α調(diào)節(jié)作用及機制,研究兩者是否形成正反饋調(diào)節(jié)。2.探究缺氧環(huán)境下,長鏈非編碼RNA HOTTIP對肝癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響以及哪個分子介導此過程。缺氧誘導模型來研究肝癌細胞在缺氧微環(huán)境中,細胞形態(tài)的變化和EMT相關(guān)標志物表達量的變化。肝癌細胞在正常培養(yǎng)和缺氧誘導下,敲低和過表達HOTTIP,研究HOTTIP對EMT相關(guān)標志物mRNA和蛋白表達量的影響。同樣采用以上實驗,來研究哪個emt誘導因子介導了長鏈非編碼rnahottip對emt標志物的調(diào)節(jié)作用。3.探究長鏈非編碼rnahottip對emt誘導因子調(diào)節(jié)的具體分子機制。生物信息學篩選出靶向的mirna。缺氧條件下,分別敲低和過表達hottip來研究mirna,emt誘導因子和emt標志物之間的相關(guān)關(guān)系。在穩(wěn)定敲低hottip的細胞中,轉(zhuǎn)染進mirnainhibitor,研究對emt誘導因子表達量的影響;最后采用雙熒光報告基因的實驗,研究hottip和mirna的競爭強弱對插入到熒光報告載體中的emt誘導因子的表達影響。敲低以及過表達hottip后,檢測wdr5蛋白的表達量變化;敲低或過表達wdr5后,檢測zeb1的mrna和蛋白表達變化;在穩(wěn)定敲低hottip組,再過表達wdr5,和對照組比較,檢測zeb1蛋白水平能否被恢復。結(jié)果:1.肝癌細胞缺氧培養(yǎng)后,長鏈非編碼rnahottip的表達量明顯升高。用dfo過表達或sirna敲低hif-1α后,檢測到hottip的表達量升高或下降。hottip的啟動子區(qū)包含hre的片段插入到pgl3熒光報告基因載體中,敲低或過表達hif-1α后,熒光活性明顯減弱或增強,表明hif-1α作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)hottip的表達。正常培養(yǎng)和缺氧誘導下,敲低或過表達hottip,hif-1α蛋白表達量明顯下降或上升;敲低hif-1α后,再過表達hottip,檢測到hif-1α的蛋白水平能被恢復。在穩(wěn)定敲低hottip的細胞中,用chx阻斷蛋白質(zhì)翻譯,hif-1α在敲低組蛋白降解的速率明顯增強;再用mg132來阻斷hif-1α降解的泛素蛋白酶體途徑,在敲低組hif-1α蛋白表達量也逐漸累積。2.缺氧誘導48h后,肝癌細胞形態(tài)變成明顯的長梭型,利于細胞的遷移。emt標志物n-cadherin、vimentin或e-cadherin的mrna水平和蛋白表達水平都明顯升高或下調(diào)。正常培養(yǎng)條件下,敲低和過表達hottip,emt標志物n-cadherin、e-cadherin和vimentin,emt誘導因子snail1、snail2、zeb1、zeb2都沒有變化,然而在缺氧誘導的條件下,敲低或過表達hottip后,只有zeb1和e-cadherin的mrna和蛋白表達水平都明顯變化。3.預測發(fā)現(xiàn)mirna-200a可能是潛在的靶基因,在缺氧條件下,敲低或過表hottip,mirna-200a表達上升或下降,zeb1表達下降或升高,e-cadherin表達升高或下降。在穩(wěn)定敲低hottip的細胞中,與對照組相比,zeb1的表達下降,e-cadherin的表達明顯上升,但轉(zhuǎn)染進了mirna-200a的inhibitor后,zeb1的表達明顯恢復,最終E-cadherin的表達下降;HOTTIP與miRNA-200a結(jié)合的區(qū)域插到雙熒光報告基因載體psiCHECK-2,隨著miRNA-200a濃度的增加,熒光活性越來越弱;正常條件和缺氧誘導下,敲低或過表達HOTTIP發(fā)現(xiàn)WDR5蛋白表達量明顯下降或上升,肝癌細胞中敲低或過表達WDR5后,檢測到ZEB1的mRNA水平?jīng)]有變化,蛋白水平明顯下降或上升。在穩(wěn)定敲低HOTTIP組,WDR5蛋白表達水平下降,ZEB1蛋白水平下降,再過表達WDR5后,ZEB1蛋白水平被明顯恢復。結(jié)論:長鏈非編碼RNA HOTTIP介導了肝癌細胞在缺氧微環(huán)境中發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的過程,通過轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α轉(zhuǎn)錄激活HOTTIP的高表達,HOTTIP作為ceRNA吸附miRNA-200a,從而促進ZEB1的表達以及HOTTIP能穩(wěn)定WDR5蛋白,同時促進ZEB1蛋白的高表達,進而抑制E-cadherin的表達,最終使肝癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:Objective : To study the effect of long - chain non - coding RNA HOTTIP on the expression of HOTTIP in hepatocellular carcinoma . The expression of hif - 1.alpha . protein was increased or decreased after hypoxia . Conclusion : Long - chain non - coding RNA HOTTIP ( HOTTIP ) plays an important role in inhibiting the expression of WDR5 protein .

【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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1 許江兵;缺氧環(huán)境中長鏈非編碼RNA HOTTIP促進肝癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機制研究[D];大連醫(yī)科大學;2017年

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本文編號：1408452