本文關(guān)鍵詞：PARP1協(xié)同PTEN在DNA損傷修復(fù)NHEJ通路中作用的研究　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：PARylation作為一種普遍存在的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾的方式,調(diào)控了多種細(xì)胞生命活動(dòng)進(jìn)程。PARP1作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的PARP蛋白超家族成員,具有多種功能性結(jié)構(gòu)域,參與了DNA損傷修復(fù)進(jìn)程,作為治療靶點(diǎn)已經(jīng)用于卵巢癌、乳腺癌等癌癥的治療。由于對(duì)于PARP1參與DNA損傷修復(fù)的具體分子機(jī)制還不是很清楚,并且PARP1對(duì)DNA雙鏈斷裂修復(fù)通路的相關(guān)調(diào)控機(jī)制還存在爭議,因此,本文探討了PARP1在DNA雙鏈斷裂修復(fù)通路NHEJ中的具體分子調(diào)控機(jī)制。我們的研究發(fā)現(xiàn),PARP1抑制劑對(duì)于BRCA基因野生型的腫瘤細(xì)胞的殺傷是有限的,這與臨床PARP抑制劑的使用策略相一致。為了使PARP抑制劑對(duì)于BRCA基因野生型的腫瘤細(xì)胞同樣有效果,我們考慮可以通過降低同源重組修復(fù)效率來實(shí)現(xiàn)。Rad51蛋白作為參與同源重組修復(fù)的重要蛋白,它的抑制會(huì)有效降低同源重組修復(fù)效率。因此我們將PARP抑制劑與Rad51抑制劑聯(lián)用,結(jié)果大幅度提高了腫瘤殺傷效果,這種聯(lián)合用藥策略可以作為一種潛在的臨床腫瘤治療方案。通過在293T細(xì)胞中過表達(dá)PARP1蛋白我們發(fā)現(xiàn),PARP1能夠提高總的NHEJ修復(fù)通路效率,分別表達(dá)不同的PARP1結(jié)構(gòu)域,結(jié)果表明總的NHEJ效率的提升主要是通過提高A-NHEJ修復(fù)通路效率實(shí)現(xiàn)的,缺失了部分功能性結(jié)構(gòu)域?qū)е铝薔HEJ效率部分的降低,因此這種修復(fù)效率的提升是PARP1蛋白結(jié)構(gòu)所依賴的。同時(shí),對(duì)于PARP1不同結(jié)構(gòu)域的研究顯示,Cleaved-PARP1包含了P24和P89兩個(gè)部分,它們失去了完整的PARP1蛋白在細(xì)胞核內(nèi)富集的特性,說明了PARP1的斷裂破壞了蛋白的核定位信號(hào),使蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的效率降低。接下來我們具體研究了PARP1蛋白對(duì)于C-NEEJ通路重要蛋白Ku70的影響,我們發(fā)現(xiàn)PARP1能夠和Ku70蛋白結(jié)合,而且這種結(jié)合是物理性結(jié)合不依賴于DNA的偶聯(lián)。同時(shí),PARP1能夠使Ku70蛋白PARylation,PARP1的這種調(diào)控依賴于它的酶活性,而且PARP1的激活受到PTEN這種抑癌基因的調(diào)控。在PTEN基因缺失的情況下,PARP1蛋白的自身PARylation被限制,不能有效的被激活而使Ku70蛋白PARylation,因此Ku70的PARylation水平和PTEN野生型情況下相比有明顯降低。在細(xì)胞遭受輻照損傷后,PTEN野生型細(xì)胞中PARP1蛋白水平檢測顯示了其時(shí)間依賴性的先降低后升高并恢復(fù)到一般水平,而在PTEN缺失的細(xì)胞中沒有檢測到PARP1蛋白的這種變化,而是趨于平穩(wěn)。當(dāng)在PTEN野生型細(xì)胞中加入PARP抑制劑處理時(shí),沒有檢測到PARP1蛋白的變化,而是像PTEN缺失的細(xì)胞PARP1水平相對(duì)穩(wěn)定不變。該結(jié)果進(jìn)一步說明了PARP1蛋白水平的改變是通過其自身酶活性而使PARP1蛋白自身PARylation修飾實(shí)現(xiàn)的。m RNA水平檢測顯示了,PARP1基因的轉(zhuǎn)錄無論是在PTEN野生型細(xì)胞還是缺失的細(xì)胞中,均沒有顯著性差異,說明PARP1蛋白自身PARylation激活后,導(dǎo)致了其蛋白的不穩(wěn)定,致使PARP1蛋白的降解,在細(xì)胞內(nèi)含量降低。綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn)了PARP1蛋白參與了NHEJ修復(fù)通路的調(diào)控,能夠促進(jìn)A-NHEJ修復(fù)通路效率,同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)PARP1這種修飾作用是受PTEN蛋白所調(diào)控的。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步闡明了PAPR1在NHEJ修復(fù)通路中的雙重調(diào)控機(jī)制,部分的解釋了目前對(duì)于PARP1蛋白參與DNA修復(fù)存在的爭議,為臨床更好的針對(duì)于不同基因型腫瘤細(xì)胞使用PARP抑制劑提供了參考依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R730.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 Huiting Wei;Xiaochun Yu;;Functions of PARylation in DNA Damage Repair Pathways[J];Genomics,Proteomics & Bioinformatics;2016年03期

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本文編號(hào)：1336634