本文關(guān)鍵詞：自噬對(duì)酸敏感離子通道1a介導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種由多種原因引起的退行性關(guān)節(jié)疾病,但具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí),酸敏感離子通道1a(acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)被胞外酸通過(guò)介導(dǎo)胞外Ca2+內(nèi)流活化,且ASIC1a介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡在RA進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。本研究主要目的是在體外探究自噬對(duì)ASIC1a介導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響,探討自噬在RA發(fā)病進(jìn)程中的作用。方法體外分離、提取及培養(yǎng)原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,給于適宜濃度的濃鹽酸刺激,體外建立早期RA模型。在此基礎(chǔ)上,采用ASIC1a特異性阻斷劑狼蛛毒素(psalmotoxin 1,Pc TX1)及ASIC1a短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,sh RNA)阻斷或沉默ASIC1a,實(shí)驗(yàn)分為正常組、p H6.0組、Pc TX1組、p H6.0+Pc TX1組和正常組、p H6.0組、ASIC1a sh RNA組、p H6.0+ASIC1a sh RNA組,分別觀察ASIC1a對(duì)自噬和凋亡的影響。采用自噬特異性阻斷劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)及Beclin1小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA)阻斷或沉默自噬,實(shí)驗(yàn)分為正常組、p H6.0組、,3-MA組、p H6.0+3-MA組和正常組、p H6.0組、Beclin1 si RNA組、p H6.0+Beclin1 si RNA組,觀察自噬對(duì)ASIC1a介導(dǎo)的酸誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體;單丹黃酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)染色觀察自噬囊泡的形成;GFP-m RFP-LC3觀察自噬成熟過(guò)程;Western blot技術(shù)分析自噬相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果胞外酸化可明顯上調(diào)自噬蛋白LC3-II水平,顯著增加胞質(zhì)內(nèi)自噬小體數(shù)量;胞外酸化(p H6.0)3h自噬蛋白LC3-II、Beclin1,凋亡相關(guān)蛋白剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切性Caspase-9均高表達(dá),該過(guò)程可被Pc TX1及ASIC1a sh RNA逆轉(zhuǎn);3-MA降低ASIC1a介導(dǎo)的細(xì)胞自噬,并增加ASIC1a介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-II、Beclin1蛋白的下調(diào),剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切性Caspase-9蛋白的上調(diào)以及細(xì)胞凋亡率的增加;此外,預(yù)處理的Beclin1 si RNA降低了自噬蛋白LC3-II、Beclin1的表達(dá),增加了凋亡蛋白剪切性PARP、剪切性Caspase-3及剪切性Caspase-9的表達(dá)以及上調(diào)了細(xì)胞凋亡率。結(jié)論結(jié)果顯示激活的ASIC1a可在體外介導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和自噬的發(fā)生,阻斷或沉默自噬可以增強(qiáng)ASIC1a介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,因此在RA發(fā)病過(guò)程中自噬可能被作為一種新的機(jī)制參與了ASIC1a介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。自噬的檢測(cè)有助于進(jìn)一步揭示早期關(guān)節(jié)損傷和RA的發(fā)病機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R593.22

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本文編號(hào)：1331690