發(fā)布時(shí)間：2017-12-23 09:25

  本文關(guān)鍵詞：SIRT1過表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響及作用機(jī)制探討　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的通過構(gòu)建沉默信息調(diào)節(jié)因子2-相關(guān)酶類-1(silent mating-type information regulation 2 homologue 1,SIRT1)基因過表達(dá)慢病毒載體,體外感染急性髓系白血病THP-1細(xì)胞株,研究上調(diào)SIRT1基因?qū)HP-1細(xì)胞細(xì)胞周期、凋亡、增殖等生物學(xué)行為的影響及可能的分子機(jī)制。方法1.鑒定SIRT1基因過表達(dá)慢病毒載體提供目的基因序列信息,由上海吉?jiǎng)P公司協(xié)助構(gòu)建SIRT1基因過表達(dá)慢病毒載體并測(cè)定病毒滴度。轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞顯微鏡觀察有綠色熒光,采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR、Western blot方法在m RNA表達(dá)及蛋白水平對(duì)已構(gòu)建完成的慢病毒載體進(jìn)行鑒定。2.過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染THP-1后細(xì)胞增殖、周期、凋亡改變使用包裝有SIRT1基因的慢病毒轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞,熒光檢測(cè),Rt-PCR驗(yàn)證SIRT1基因在m RNA水平的表達(dá),western bloting技術(shù)驗(yàn)證SIRT1蛋白表達(dá)后,采用CCK-8法繪制基因過表達(dá)后細(xì)胞生長曲線,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)基因過表達(dá)后THP-1細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、及細(xì)胞凋亡情況。3.檢測(cè)轉(zhuǎn)染后THP-1細(xì)胞惡性細(xì)胞行為相關(guān)因子實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)sirtuins家族基因;抑癌基因:p21、P53;原癌基因:已知與白血病相關(guān)的原癌基因細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、核因子-κB(Nuclear factorκB,NF-κB);細(xì)胞增殖/分化相關(guān)因子:粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor,G-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子受體(Granulocyte Colony Stimulating Factor Receptor,G-CSFR)基因、C/EBP-a和C/EBP-β;細(xì)胞凋亡相關(guān)基因:B細(xì)胞淋巴瘤因子2(B cell leukemia/lymphoma 2,Bcl2)、Bcl相關(guān)X蛋白(Bcl-associated X protein,Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)3、caspase9基因m RNA的表達(dá)情況,WB法檢測(cè)各組細(xì)胞活化型caspase3的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異采用Student t檢驗(yàn)或者單因素方差分析(One-Way ANOVA)。不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)采用一般線性模型的重復(fù)測(cè)量資料方差分析,對(duì)資料進(jìn)行球形檢驗(yàn),不滿足Huynh-Fledt條件時(shí)采用Greenhouse-Geisser校正。結(jié)果1、過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞后,經(jīng)RT-PCR、western bloting鑒定,m RNA水平檢測(cè)SIRT1基因表達(dá)上調(diào)2倍以上,目的蛋白表達(dá)顯著增高(p0.05),SIRT1基因過表達(dá)慢病毒構(gòu)建成功。2、慢病毒轉(zhuǎn)染MOI為100時(shí),成功建立SIRT1基因過表達(dá)THP-1細(xì)胞系,RT-PCR及western bloting鑒定m RNA及目的蛋白均顯著增高。3、SIRT1基因過表達(dá)慢病毒感染THP-1細(xì)胞后,其細(xì)胞生長曲線與對(duì)照組THP-1細(xì)胞有明顯差異,明顯抑制THP-1細(xì)胞生長;轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞細(xì)胞增殖指數(shù)均顯著下降,細(xì)胞增殖指數(shù)顯著低于空病毒轉(zhuǎn)染對(duì)照組,p值=0.004;SIRT 1慢病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞細(xì)胞周期發(fā)生G1/G0期阻滯;SIRT 1慢病毒過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞細(xì)胞凋亡率明顯升高;4、SIRT1基因過表達(dá)THP-1細(xì)胞的SIRT1、SIRT3、SIRT4 m RNA表達(dá)較空載體con145轉(zhuǎn)染組顯著增高(p0.05);Sirt1過表達(dá)后,THP-1細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因caspase3的m RNA表達(dá)顯著增高(p值為0.002)可檢出caspase3蛋白表達(dá);THP-1細(xì)胞的原癌基因NF-κB下調(diào),且上調(diào)THP-1細(xì)胞的抑癌基因p21的表達(dá),下調(diào)BAX、Bcl2的m RNA表達(dá)。結(jié)論SIRT1基因過表達(dá)慢病毒載體可以通過影響細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1/G0期阻滯,明顯抑制細(xì)胞增殖�？赡芡ㄟ^影響細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá),影響細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。SIRT1基因可能在急性髓系白血病中發(fā)揮抑癌作用,作用機(jī)制可能與細(xì)胞增殖、凋亡及周期相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R733.7

【參考文獻(xiàn)】

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