本文關(guān)鍵詞：膠類中藥蛋白質(zhì)的分析及鑒定研究　出處：《江蘇大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：膠類中藥由動物的皮、甲、骨、鱗或角等藥用部位經(jīng)過長時間熬制等加工而成,主要具有補血、止血等功效。由于膠類中藥需求量大,市面上偽品和摻偽品較多,如豬皮膠和雜皮膠等,因而成為近年來鑒定研究的熱點�！吨袊幍洹分心z類中藥的質(zhì)量控制體系雖然愈發(fā)完善,然而其專屬性鑒定的研究基礎(chǔ)仍然相對薄弱。因此,開展相應(yīng)的基礎(chǔ)研究并最終實現(xiàn)對膠類中藥的準(zhǔn)確鑒別顯得十分急迫。本論文圍繞膠類中藥及其基源動物藥用部位中的蛋白質(zhì)開展了分析研究,以期為膠類中藥的鑒定提供依據(jù),并為膠類中藥的補益活性物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容分為以下幾個部分:1.膠類中藥蛋白質(zhì)的含量測定與比較以水作為溶劑,料液比為1 100,85℃恒溫水浴加熱20 mins,制備膠類中藥供試液,并采用Bradford和BCA法測定蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明,Bradford法(4.64%~12.74%)測定的膠類中藥對照藥材的蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)低于BCA法(35.82%~46.28%),提示精氨酸(Arg)和芳香性氨基酸(如Phe、Tyr、Trp)可能并不是組成膠類中藥中蛋白質(zhì)的主要氨基酸。此外,不同批次的阿膠、龜甲膠和鹿角膠商品中蛋白質(zhì)的含量有一定差異;其中,阿膠蛋白質(zhì)含量與其對照藥材差異較小,而龜甲膠和鹿角膠的蛋白質(zhì)含量均高于相應(yīng)的對照藥材。2.膠類中藥氨基酸及膠原蛋白的含量測定利用氨基酸分析儀測定膠類中藥中17種氨基酸的含量。結(jié)果表明,膠類中藥中氨基酸種類和含量較為豐富;阿膠、龜甲膠、鹿角膠中氨基酸含量的高低順序基本一致,尤其是Gly和Pro的含量較高。主成分分析可知,Gly、Pro為三種膠類中藥的共同特征氨基酸,表明其蛋白質(zhì)類化學(xué)成分主要由膠原蛋白構(gòu)成。此外,聚類分析顯示,市售膠類中藥商品大致可被歸為三類。然后,以柱前衍生化-高效液相色譜法測定了膠類中藥的L-Hyp,并以折算系數(shù)計算膠原蛋白的含量。結(jié)果表明,阿膠、龜甲膠和鹿角膠對照藥材的L-Hyp含量依次為9.11%、6.93%和8.06%,膠原蛋白含量為64.65%、76.92%和57.23%。18批膠類中藥商品中L-Hyp和膠原蛋白的含量有一定差異;阿膠商品與對照藥材中兩者的含量較為接近,而鹿角膠和龜甲膠商品中兩者的含量均遠(yuǎn)高于對照藥材。3.基源動物藥用部位及膠類中藥中蛋白質(zhì)的電泳分析利用SDS-PAGE分析了膠原、基源動物藥用部位和膠類中藥的蛋白質(zhì)組成。結(jié)果表明,基源動物藥用部位(驢皮、龜甲和鹿角脫盤)含有豐富的蛋白質(zhì),且在10 k Da~250 k Da區(qū)間均有分布,而經(jīng)加工后得到的阿膠、龜甲膠和鹿角膠中蛋白質(zhì)均呈彌散分布,未見明顯條帶。三種膠類中藥的SDS-PAGE及2-DE蛋白譜的主要差別在于:阿膠中蛋白質(zhì)的分子量范圍介于15 k Da~250 k Da,甚至更高,而鹿角膠和龜甲膠則基本上50 k Da,區(qū)域有所不同,可為膠類中藥的鑒定提供一定參考。4.藥用部位蛋白質(zhì)在加工過程中的動態(tài)變化基于電泳技術(shù)研究了藥用部位蛋白質(zhì)在加工過程中的動態(tài)變化。結(jié)果表明,經(jīng)短時間煎煮,驢皮、龜甲和鹿角脫盤中的蛋白質(zhì)能夠較快地被溶出,可能含有水溶性蛋白質(zhì)和鹽溶性蛋白質(zhì)。此后,隨著煎煮時間的延長以及加入輔料(冰糖、黃酒和豆油),藥用部位中大分子的蛋白質(zhì)可能發(fā)生了較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變化(如蛋白質(zhì)降解、聚合),泳道逐漸出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。5.胰蛋白酶消化—MALDI-TOF/TOF-MS分析膠類中藥的多肽片段以SDS-PAGE分離得到的蛋白質(zhì)條帶為來源,經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS分析并進行數(shù)據(jù)庫匹配檢索,從驢皮中鑒定出7個特征蛋白,從龜甲中鑒定出1個特征蛋白;以2-DE分離得到的蛋白質(zhì)斑點為來源,經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS分析并進行數(shù)據(jù)庫匹配檢索,從驢皮中鑒定出另外12個特征蛋白,從龜甲中鑒定出另外6個特征蛋白。此外,利用胰蛋白酶消化膠類中藥蛋白質(zhì)(50~75 k Da及25 k Da上方),將所得到的多肽片段混合物以MALDI-TOF/TOF-MS進行分析,獲取了多肽片段的指紋圖譜,并從中選取了32個差異性多肽片段,以期為膠類中藥的鑒定提供參考。6.膠原蛋白酶消化—Nano LC-Orbitrap MSD分析膠類中藥的多肽片段以膠原蛋白酶分別消化阿膠、鹿角膠和龜甲膠的總蛋白質(zhì)得到肽段混合物,并利用Nano LC-Orbitrap MSD進行分析,然后通過Mascot檢索和PEAKS軟件de novo sequencing解析了肽段的氨基酸序列,并從中發(fā)現(xiàn)了共計14個潛在特征性肽段,其中5個來源于阿膠,5個來源于龜甲膠,4個來源于鹿角膠。此外,將這些潛在特征性肽段導(dǎo)入BLAST在線分析并nrdb為依托,發(fā)現(xiàn)它們大部分來源于哺乳動物。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R284.1

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 林嘉輝;陳炳藝;龍美兵;郭文韜;王和鳴;李楠;;龜甲膠和鹿角膠含藥血清對豚鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞JNK及p38 MAPK基因表達的影響[J];中國中醫(yī)骨傷科雜志;2016年10期

2 劉艷艷;董書光;耿加亮;譚晴晴;張全芳;步迅;;阿膠加工工藝過程中DNA降解規(guī)律研究[J];藥學(xué)研究;2016年09期

3 陳炳藝;陳澤華;林嘉輝;王和鳴;李楠;;龜甲膠、鹿角膠調(diào)控MKK基因表達促進豚鼠OA軟骨細(xì)胞增殖的研究[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2016年07期

4 Wen-long LI;Hai-fan HAN;Lu ZHANG;Yan ZHANG;Hai-bin QU;;基于近紅外光譜技術(shù)的東阿阿膠生產(chǎn)廠家和存放時間鑒定方法研究（英文）[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2016年05期

5 張飄飄;閻曉丹;杜鵬程;王愛平;靳洪濤;;阿膠的化學(xué)成分及其藥理毒理學(xué)研究進展[J];山東醫(yī)藥;2016年09期

6 江東龍;陳芳;熊丹丹;盧建中;;柱前衍生化HPLC法同時測定龜甲膠中14種水解氨基酸含量[J];藥物分析雜志;2015年10期

7 陳志宣;龔國利;;常見阿膠偽品的熒光PCR分子檢測[J];陜西科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2015年03期

8 汝文文;和嫻嫻;鈐莉妍;孫陽恩;韓麗;王東亮;;阿膠對圍絕經(jīng)期大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax表達的影響[J];中國藥物評價;2015年03期

9 王平陽;吳凡;趙巧玲;裘智勇;夏定國;唐順明;沈興家;;家蠶幼蟲蛻皮前后頭胸部蛋白質(zhì)的差異表達分析[J];蠶業(yè)科學(xué);2015年02期

10 陳佳;程顯隆;魏鋒;張倩倩;馬雙成;;超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法檢測復(fù)方阿膠漿中阿膠[J];藥物分析雜志;2015年02期

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1 魯春曉;東阿阿膠制作技藝產(chǎn)業(yè)化研究[D];山東大學(xué);2011年

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