本文關(guān)鍵詞：運動鍛煉對博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化及肥胖相關(guān)肺損傷的保護作用及機制　出處：《上海體育學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究目的肺組織是機體唯一大面積與外界空氣接觸的內(nèi)臟器官,極易受到多種損害。運動鍛煉作為一種非藥物干預(yù)方式,對治療多種慢性疾病以及肥胖相關(guān)的代謝綜合癥均有良好效果。作為一種新型氣體信號分子,硫化氫(hydrogen sulfide,H_2S)具有重要的生理調(diào)節(jié)功能,H_2S代謝紊亂與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。肺纖維化是多種肺損傷共有的病理改變并影響疾病的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。本文第一部分?jǐn)M通過建立博來霉素(Bleomycin,BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型,探討運動鍛煉能否通過提高機體H_2S的水平而改善BLM誘導(dǎo)的肺纖維化。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids,GCs)是臨床上應(yīng)用最為廣泛的激素類藥物,具有抗炎、抗休克等多種生物學(xué)效應(yīng)。GCs主要在腎上腺合成,但有研究發(fā)現(xiàn)在腎上腺以外的多種器官均有GCs合成酶與代謝酶的表達(dá)并對局部器官中GCs的含量和活性產(chǎn)生影響。本課題組前期研究膿毒癥腎上腺皮質(zhì)耗竭時發(fā)現(xiàn)H_2S可促進腎上腺中GCs的合成,那么H_2S是否同樣對肺組織中GCs的含量和活性產(chǎn)生影響?綜合考慮炎癥與纖維化的關(guān)系及GCs的抗炎作用,我們很想知道運動鍛煉能否通過提高H_2S水平調(diào)節(jié)局部GCs的合成和代謝進而改善肺組織炎癥并影響肺纖維化狀態(tài)。由于肥胖的典型病理改變之一即為全身慢性炎癥狀態(tài),因此,本論文第二部分通過建立肥胖小鼠的運動模型,首先探討了運動鍛煉能否通過調(diào)節(jié)局部GCs的合成或代謝而改善肥胖相關(guān)的肺組織炎癥。運動鍛煉通過H_2S調(diào)節(jié)局部GCs進而影響肺纖維化的工作我們將在后續(xù)研究中陸續(xù)開展。研究方法第一部分:首先驗證外源性補充H_2S能否改善BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化,選擇ICR小鼠40只,隨機分為4組:對照組(Control,n=10)、博來霉素組(BLM,n=10)、硫化氫組(H_2S,n=10)、博來霉素+硫化氫組(BLM+H_2S,n=10)。然后探討運動鍛煉對肺纖維化的影響,選擇ICR小鼠隨機分為4組:對照組(Control,n=10)、博來霉素組(BLM,n=10)、運動鍛煉組(Ex,n=10)、博來霉素+運動鍛煉組(BLM+Ex,n=10)。以5天/周、45min/天、12m/min的運動方案跑臺鍛煉4周后,進行肺纖維化模型制作,即對BLM組和BLM+Ex組行進行氣管滴注博來霉素,Control組和Ex組滴注生理鹽水。待小鼠清醒后繼續(xù)2周的跑臺鍛煉,6周后收取肺組織樣本。采用HE(Hematoxylin and eosin)和Masson染色法檢測肺組織的病理學(xué)改變和膠原沉淀情況;采用ELISA法檢測羥脯氨酸(hydroxyproline)、Ⅰ型膠原(Collagen I)及TGF-β的含量;采用Western blot方法檢測上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin和纖維化標(biāo)記蛋白α-SMA的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄激活因子(P-Smad2、P-Smad3、Smade4)以及硫化氫合成酶CBS和CSE的蛋白表達(dá)。第二部分:選擇SPF級C57BL/6野生型小鼠(WT)和ob/ob肥胖小鼠(ob)作為研究區(qū)對象,根據(jù)隨機原則小鼠被分為4組:C57BL/6靜置組(Sed-WT組,n=10)、C57BL/6運動組(Ex-WT 組,n=10)、ob/ob 靜置組(Sed-ob 組,n=10)、ob/ob 運動組(Ex-ob組,n=10)。采用6天/周、1h/天、12m/min的運動方案進行跑臺鍛煉6周,運動干預(yù)結(jié)束后收取肺組織和血漿樣本。采用ELISA法檢測肺組織炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-18、MCP-1的水平以及MPO的活性和皮質(zhì)酮的含量;采用免疫組織化學(xué)法標(biāo)記CD68檢測ob小鼠肺組織巨噬細(xì)胞浸潤程度以及驗證GCs關(guān)鍵合成酶 StAR、CYP11A1、CYP21、3β-HSD、CYP11B1 與代謝酶 11β-HSD1、11β-HSD2在小鼠肺組織中是否表達(dá);采用免疫熒光標(biāo)記、RT-PCR和Western blot方法,定量分析運動鍛煉對糖皮質(zhì)代謝關(guān)鍵酶11β-HSDi和11β-HSD2的影響。RU486是一種GCs受體拮抗劑。為了進一步驗證GCs參與運動鍛煉的抗炎效果,我們把WT和ob小鼠隨機分為6組:Sed-WT組(n=7),Ex-WT組(n=7),Ex-WT+RU486 組(n=7),Sed-ob組(n=7),Ex-ob 組(n=7),Ex-ob+RU486組(n=7)。每天注射RU486(30mg/kg/d)或生理鹽水,運動方案同上。運動干預(yù)結(jié)束后收取肺組織,采用ELISA方法檢測肺組織炎癥細(xì)胞因子水平,每周記錄一次小鼠體重變化。研究結(jié)果第一部分:1.補充外源性H_2S可以改善BLM誘導(dǎo)小鼠肺上皮細(xì)胞減少及衰老:免疫熒光顯示,與Control組相比,BLM組小鼠肺組織E-cadherin的表達(dá)顯著減少,p53和p21的表達(dá)顯著增加;與BLM組相比,BLM+H_2S組小鼠肺組織E-cadherin的表達(dá)顯著增加,p53和p21的表達(dá)顯著減少。2.補充外源性H_2S可以改善BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化:ELISA結(jié)果顯示,與Control組相比,BLM組小鼠肺組織中羥脯氨酸、I型膠原和TGF-β的含量顯著升高(p0.01,p0.01,p0.01);與BLM組相比,BLM+H_2S組小鼠肺組織中羥脯氨酸、Ⅰ型膠原和TGF-β的含量顯著降低(p＜0.05,p0.01,p0.01)。3.運動鍛煉可以改善BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化:HE和Masson染色結(jié)果顯示,與Control組相比,BLM組小鼠肺組織肺泡壁增厚,結(jié)構(gòu)破壞,膠原沉淀增多;與BLM組相比,BLM+Ex組小鼠肺組織肺泡壁變薄,結(jié)構(gòu)相對完整,膠原沉淀明顯減少。ELISA結(jié)果顯示,與Control組相比,BLM組小鼠肺組織羥脯氨酸、I型膠原及TGF-β的含量均顯著升高(p0.01,p0.01,p0.05);與BLM組相比,BLM+Ex組小鼠肺組織羥脯氨酸、I型膠原及TGF-β的含量均,顯著降低(p0.01,p0.01,p0.05)。4.運動鍛煉增加上皮黏附分子E-cadherin且降低纖維化標(biāo)志蛋白α-SMA的表達(dá):與Control組相比,BLM組小鼠肺組織E-cadherin表達(dá)顯著減少(p0.01),α-SMA表達(dá)顯著增加(p0.01);與BLM組相比,BLM+Ex組小鼠肺組織E-cadherin表達(dá)顯著增加(p0.01),α-SMA表達(dá)顯著減少(p0.05)。5.運動鍛煉抑制BLM誘導(dǎo)TGF-β信號通路的激活:與Control組相比,BLM組小鼠肺組織p-Smad2、p-Smad3、Smad4表達(dá)水平均顯著升高(p0.01,p0.05,p0.01);與BLM組相比,BLM+Ex組小鼠肺組織中這三種蛋白表達(dá)水平又均顯著降低(p0.01,p0.05,p0.01)。6.運動鍛煉增加小鼠肺組織中CBS和CSE的表達(dá):與Control相比,BLM組小鼠肺組織CBS和CSE的蛋白表達(dá)顯著降低(p0.01,p0.01);與BLM組相比,BLM+Ex組小鼠肺組織CBS和CSE的蛋白表達(dá)顯著升高(p＜0.01 p0.05)。第二部分:1.運動鍛煉降低ob/ob小鼠肺組織炎癥細(xì)胞因子水平:與Sed-WT組相比,Sed-ob組小鼠肺組織炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18和MCP-1水平均顯著升高(p0.01,p0.01,p0.01),IL-6無顯著性改變;與Sed-ob組相比,Ex-ob組小鼠肺組織炎癥狀態(tài)明顯改善,主要表現(xiàn)為IL-β、IL-18和MCP-1水平顯著降低(P0.05,p0.05，p0.01)。2.運動鍛煉改善ob/ob小鼠肺組織巨噬細(xì)胞浸潤程度：與Sed-WT組相比,Sed-ob組小鼠肺組織CD68陽性細(xì)胞顯著增多(P0.01);與Sed-ob組相比,Ex-ob組小鼠肺組織CD68陽性細(xì)胞顯著減少(P0.01)。3.運動鍛煉降低ob小鼠肺組織MPO活性:與Sed-WT組相比,Sed-ob組小鼠肺組織MPO活性顯著升高(P0.01);與Sed-ob組相比,Ex-ob組小鼠肺組織MPO活性顯著降低(P0.05)。4.運動鍛煉顯著增加小鼠肺組織皮質(zhì)酮含量,對血漿皮質(zhì)酮水平無顯著性影響:與Sed-WT組相比,Ex-WT組小鼠肺組織皮質(zhì)酮水平顯著升高(P0.05),Sed-ob組小鼠肺組織皮質(zhì)酮水平顯著降低(P0.05);與Sed-ob組相比,Ex-ob組小鼠肺組織皮質(zhì)酮含量顯著升高(P0.01)。血漿皮質(zhì)酮水平無顯著性改變。5.GCs關(guān)鍵合成酶CYP11B1缺失于小鼠肺組織,且運動鍛煉和肥胖并不改變這一現(xiàn)象:免疫組化結(jié)果顯示,GCs關(guān)鍵合成酶之一 CYP11B1在小鼠肺組織中未見表達(dá),其余關(guān)鍵酶StAR、CYP11A1、3β-HSD和CYP21以及代謝酶11β-HSD1和11β-HSD2在小鼠肺組織中均有表達(dá),且運動鍛煉和肥胖均未改變CYP11B1在肺組織中呈陰性表達(dá)的結(jié)果。6.運動鍛煉顯著增加小鼠肺組織11β-HSD1的含量:免疫熒光結(jié)果顯示,與Sed-WT組相比,Ex-WT組小鼠肺組織11β-HSD1的表達(dá)顯著增加(P0.01),11β-HSD2無顯著性變化;與Sed-ob組相比,Ex-ob組小鼠肺組織11β-HSD1的表達(dá)顯著增加(P0.01),11β-HSD2無顯著性變化。Western blot結(jié)果也顯示,運動鍛煉顯著增加11β-HSD1的表達(dá)(P0.01),但不影響11β-HSD2的表達(dá)。RT-PCR結(jié)果與Western blot結(jié)果趨勢一致,運動鍛煉顯著增加11β-HSD1的mRNA水平(P0.05),但不影響11β-HSD2的mRNA水平。7.RU486阻斷運動鍛煉的抗炎效果：與Ex-WT組相比,Ex-WT+RU486組小鼠肺組織中IL-1β、IL-18和MCP-1水平以及MP0的活性均顯著升高(P0.05,P0.01,P0.01,P0.05);與Ex-ob組相比,Ex-ob+RU486組小鼠肺組織上述細(xì)胞因子水平均顯著升高(P0.01,P0.01,P0.05,P0.01)。8.小鼠體重變化:與Sed-WT組相比,Ex-WT組小鼠體重顯著下降(p0.05),Ex-WT+RU486組小鼠體重顯著升高(p0.05);與Sed-ob組相比,Ex-ob組小鼠體重顯著降低(p0.01),Ex-ob+RU486組小鼠體重顯著升高(p0.01)。9.運動鍛煉增加小鼠肺組織CBS和CSE的蛋白表達(dá):與Sed-WT組相比,Sed-ob組小鼠肺組織CBS和CSE的表達(dá)均顯著下降(p0.01,p0.01);與Sed-ob組相比,Ex-ob組小鼠肺組織CBS和CSE的表達(dá)顯著升高(p0.01,p0.05)。研究結(jié)論運動鍛煉通過抑制TGF-β信號通路的激活和促進GCs活性的增強,改善了BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化和肥胖相關(guān)的肺組織炎癥,其可能的機制是運動鍛煉促進了小鼠肺組織中H_2S水平的提高。
【學(xué)位授予單位】：上海體育學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R87

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8 楊s，

本文編號：1314357