本文關(guān)鍵詞：木犀草素對(duì)流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞的作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究　出處：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的流感病毒是全球范圍內(nèi)危害較高的病原體,常表現(xiàn)為季節(jié)性流行,其中甲型流感病毒是造成感染及死亡的主要病原體,較容易通過突變和重配驅(qū)動(dòng)進(jìn)化發(fā)生變異,常會(huì)造成災(zāi)難性的大流行。流感屬中醫(yī)"外感熱病",祖國醫(yī)學(xué)在流感的防治方面積累了很多經(jīng)驗(yàn),利用中醫(yī)藥獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)研制新型的抗流感藥劑,對(duì)流感的防治有重要而深遠(yuǎn)的意義。本實(shí)驗(yàn)選用木犀草素是在其原有的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、免疫調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等藥效作用基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究其對(duì)流感病毒的作用。我們發(fā)現(xiàn)它具有抗病毒作用,因此本實(shí)驗(yàn)選用甲型流感病毒H1N1感染肺癌上皮細(xì)胞A549細(xì)胞株作為體外細(xì)胞培養(yǎng)模型,研究木犀草素體外抗流感病毒作用的分子機(jī)制。同時(shí)利用基因芯片、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western-blot等實(shí)驗(yàn)方法,篩查出差異表達(dá)基因,找到調(diào)控的相關(guān)炎性細(xì)胞因子和細(xì)胞凋亡因子等,為木犀草素臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。方法1.木犀草素體外對(duì)H1N1感染A549細(xì)胞作用的影響將A549細(xì)胞復(fù)蘇、傳代3-4次。篩選出生長狀態(tài)良好的細(xì)胞培養(yǎng)瓶,調(diào)整細(xì)胞濃度到1.5×105mL~(-1),小心接種于96孔板中。采用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)計(jì)算出木犀草素抗病毒的活性指數(shù),根據(jù)Reed-Muench公式計(jì)算出最大無毒濃度(TC0)以及50%細(xì)胞中毒濃度(TC50);檢測(cè)不同時(shí)間和作用方式時(shí)木犀草素的吸光度,找出木犀草素抗病毒最佳作用方式,并計(jì)算出半數(shù)抑制濃度(IC50)以及治療指數(shù)(TI)。2.木犀草素體外對(duì)流感病毒H1N1誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá)干預(yù)作用的影響設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組(A)、病毒感染組(B)、奧司他韋對(duì)照組(C:0.75mg·L~(-1))、木犀草素高劑量組(D:25mg·L~(-1))和木犀草素低劑量組(E:6.25mg·L~(-1))。細(xì)胞對(duì)照組不加病毒,其他組均感染流感病毒2h后,吸棄病毒液,用PBS清洗,加入以上各組藥物,作用24h后吸棄上清,用PBS清洗1次后,加入細(xì)胞裂解液,提取各組總RNA,通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western-blot)的方法檢測(cè)IL-1、IL-10、IFN-y、TNF-a 的 mRNA 的表達(dá)變化。3.木犀草素對(duì)流感病毒感染細(xì)胞TLR信號(hào)通路調(diào)節(jié)作用的影響基因芯片用于篩選流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞后TLR信號(hào)通路的差異表達(dá)基因。通過Real-Time PCR和Western-blot檢測(cè)肺組織Toll樣受體3(Toll-like receptor 3,TLR 3)、Toll 樣受體 7(Toll-like receptor 7,TLR 7)、髓樣分化因子 88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)的 mRNA和蛋白表達(dá)的變化。4.木犀草素對(duì)流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞引發(fā)凋亡的調(diào)控作用設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組(A)、病毒感染組(B)、奧司他韋對(duì)照組(C:0.75 mg·L~(-1))、木犀草素D組(25mg·L~(-1))和木犀草素E組(6.25mg·L~(-1))。細(xì)胞對(duì)照組不加病毒,其他組均感染流感病毒2h后,吸棄病毒液,用PBS清洗,加入以上各組藥物,作用24h后吸棄上清,用PBS清洗1次后,加入細(xì)胞裂解液,放置于一80℃冰箱中冷凍過夜。提取各組總RNA,采用基因芯片技術(shù),查找基因信息功能及生物路徑,篩選出與凋亡通路中密切相關(guān)的差異表達(dá)基因,進(jìn)行討論。結(jié)果1.木犀草素體外對(duì)流感病毒H1N1增殖干預(yù)效果的影響木犀草素的半數(shù)中毒濃度為39.810μg·mL~(-1),最大無毒濃度為25.0μg·mL~(-1);濃度在12.5-25.0μg·mL~(-1),木犀草素作用48-60 h,對(duì)H1N1所致的細(xì)胞病變作用有明顯的抑制作用。病毒感染后2 h加入25.0μg·mL~(-1)濃度的木犀草素,抗病毒有效率最高為(87.0±1.71)%。計(jì)算該條件下木犀草素半數(shù)抑制濃度為11.282μg·mL~(-1),治療指數(shù)為3.528。2.木犀草素體外對(duì)流感病毒H1N1誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá)干預(yù)作用的影響通過KEGG pathway分析涉及炎性因子分泌和轉(zhuǎn)錄的變化基因。與細(xì)胞對(duì)照組(A)相比,病毒感染組(B)差異表達(dá)基因TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-1明顯上調(diào)(P0.01);與H1N1感染組(B)比較,奧司他韋組(C)對(duì)差異表達(dá)基因IFN-γ、IL-10和IL-1明顯下調(diào)(P0.01);木犀草素高劑量組(D)對(duì)差異表達(dá)基因,TNF-a、IFN-γ、IL-10和IL-1明顯下調(diào)(P0.01);木犀草素低劑量組(E)對(duì)差異表達(dá)基因,IFN-γ、IL-10和IL-1明顯下調(diào)(P0.01或P0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示,與細(xì)胞對(duì)照組(A)比較,H1N1感染組(B)TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-1的mRNA表達(dá)均明顯升高(P0.01);與H1N1感染組(B)比較,奧司他韋對(duì)照組(C)的TNF-α、IFN-γ、IL-10和IL-1的mRNA表達(dá)明顯降低(P0.01);木犀草素組(D和E)的TNF-α、IFN-y、IL-10和IL-1表達(dá)均明顯降低(P0.01)。Western-blot 提示,H1N1 病毒感染組(B 組)TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-1蛋白表達(dá)較細(xì)胞對(duì)照組(A)顯著升高(P0.01),與H1N1病毒感染組(B組)相比,木犀草素高低劑量組(D和E組)的TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL-1蛋白表達(dá)不同程度降低(P0.01)。3.木犀草素對(duì)流感病毒感染細(xì)胞TLR信號(hào)通路調(diào)節(jié)作用的影響通過KEGG pathway分析涉及TLR信號(hào)通路的細(xì)胞因子。與細(xì)胞對(duì)照組(A)相比,H1N1 感染組(B)差異表達(dá)基因 Myd88、TLR3、TLR7、IRAK4、IRF7、TRAF6明顯上調(diào)(P0.01);與H1N1感染組(B)比較,奧司他韋對(duì)照組(C)對(duì)差異表達(dá)基因 Myd88、TLR3、TLR7、IRAK4、IRF7、TRAF6 明顯下調(diào)(P0.01);木犀草素高劑量組(D)對(duì)差異表達(dá)基因Myd88、TLR3、TLR7、IRF7、TRAF6明顯下調(diào)(P0.05或P0.01);木犀草素低劑量組(E)對(duì)差異表達(dá)基因Myd88、TLR7、IRAK4、IRF7明顯下調(diào)(P0.01)。PCR結(jié)果:與細(xì)胞對(duì)照組(A)比較,H1N1感染組(B)TLR3、TLR7、MyD88的mRNA表達(dá)均明顯升高(P0.01或P0.05)。與H1N1感染組(B)比較,奧司他韋對(duì)照組(C)的TLR3、TLR7、MyD88的mRNA表達(dá)明顯降低(P0.01或P0.05);木犀草素組(D和E)的TLR3、TLR7、MyD88的mRNA表達(dá)均明顯降低(P0.01)。Western-blot 提示,H1N1 病毒感染組(B 組)TLR3、TLR7、MyD88蛋白表達(dá)較細(xì)胞對(duì)照組(A)顯著升高(P0.01),與H1N1病毒感染組(B組)相比,木犀草素高低劑量組(D和E組)的TLR3、TLR7、MyD88蛋白表達(dá)不同程度降低(P0.01)。4.木犀草素對(duì)流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞引發(fā)凋亡的調(diào)控作用通過KEGG pathway分析信號(hào)通路的傳導(dǎo)。與細(xì)胞對(duì)照組(A)相比,病毒感染組(B)差異表達(dá)基因 Caspase3、Caspase6、Caspase7、Caspase8、Caspase9、TRAIL、Myd88、IL1 α 和 IL1 β 明顯上調(diào),以 TRAIL 尤為明顯(P0.01);與 H1N1感染組(B)比較,奧司他韋組(C)對(duì)差異表達(dá)基因Caspase3、Caspase6、Caspase7、Caspase8、Caspase9 和 Myd88 明顯下調(diào)(P0.01);木犀草素組(D和 E)對(duì)差異表達(dá)基因 Caspase3、Caspase6、Caspase7、Caspase8、Caspase9 和Myd88明顯下調(diào)(P0.01)。RT-PCR提示,與細(xì)胞對(duì)照組(A)比較,H1N1感染組(B)Caspase3、Caspase8 和 Myd88 的 mRNA 表達(dá)均明顯升高(P0.01);與 H1N1 感染組(B)比較,奧司他韋對(duì)照組(C)的Caspase3、Caspase8和Myd88的mRNA表達(dá)明顯降低(P0.01);木犀草素組(D和E)的Caspase3、Caspase8和Myd88的mRNA表達(dá)均明顯降低(P0.01),該結(jié)果和基因芯片表達(dá)的結(jié)果基本相符。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)利用基因芯片、RT-PCR、Western blot方法從基因、mRNA和蛋白質(zhì)等方面較全面分析了木犀草素對(duì)流感病毒H1N1感染A549細(xì)胞的干預(yù)作用及機(jī)制。結(jié)果顯示,木犀草素對(duì)流感病毒的增殖有較強(qiáng)的抑制作用,同時(shí)也能有效抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá),影響TLR信號(hào)通路以及凋亡相關(guān)因子的表達(dá),從而減輕病毒對(duì)宿主細(xì)胞的免疫損傷,減少細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抗病毒的作用。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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1 于卓男;林樹鵬;顧立剛;吳s，

本文編號(hào)：1310407