本文關(guān)鍵詞：靶向調(diào)控RAC1與鼻咽癌放射敏感性關(guān)系的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： RAC1 RNA干擾 過(guò)表達(dá) 鼻咽癌 移植瘤 放射增敏

【摘要】：目的:構(gòu)建穩(wěn)定沉默和過(guò)表達(dá)RAC1基因的低分化鼻咽癌CNE-2細(xì)胞系,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,在體內(nèi)研究靶向調(diào)控RAC1與鼻咽癌放射敏感性的關(guān)系,證實(shí)RAC1作為鼻咽癌放射治療增敏靶點(diǎn)的可能性。方法:1.利用RNA干擾和基因過(guò)表達(dá)基因重組技術(shù),構(gòu)建沉默和過(guò)表達(dá)RAC1基因的慢病毒表達(dá)載體,感染鼻咽癌CNE-2細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡和Western blot法篩選出最佳感染條件和最佳沉默靶序列,建立穩(wěn)定沉默和過(guò)表達(dá)RAC1基因的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞系。2.對(duì)沉默和過(guò)表達(dá)RAC1基因的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞,采用MTT法繪制生長(zhǎng)曲線,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化,Western blot法檢測(cè)RAC1/NADPH信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白P67、P47和RAC1的表達(dá)情況。3.將沉默和過(guò)表達(dá)RAC1基因的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞懸液接種于裸鼠皮下,構(gòu)建鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,接種14 d給予4 Gy單次照射處理,照射10 d后處死裸鼠。記錄裸鼠一般情況、體重和移植瘤重量及體積變化,繪制裸鼠體重變化曲線、移植瘤生長(zhǎng)曲線。取瘤體組織,HE染色觀察瘤體的病理學(xué)變化,免疫組化和Western blot法檢測(cè)RAC1/NADPH信號(hào)通路中RAC1、P67和P47關(guān)鍵蛋白表達(dá)情況,透射電鏡觀察瘤體組織細(xì)胞中超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果:1.成功構(gòu)建沉默和過(guò)表達(dá)RAC1基因的慢病毒表達(dá)載體,測(cè)序結(jié)果顯示插入序列正確。病毒顆粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞后分別獲得RAC1沉默的RAC1(-)細(xì)胞,RAC1過(guò)表達(dá)的RAC1(+)細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察其感染效率高于95%,Western blot結(jié)果顯示RAC1(+)細(xì)胞RAC1蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組,RAC1(-)細(xì)胞RAC1蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組。2.體外實(shí)驗(yàn)表明,與對(duì)照組比較,鼻咽癌RAC1(-)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度增加,遷移速度減慢,細(xì)胞中P67、P47和RAC1蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05);RAC1(+)細(xì)胞增殖速度沒(méi)有改變,但是遷移速度加快,并上調(diào)NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基P67、P47和RAC1蛋白表達(dá)(P0.05);但不管是沉默還是過(guò)表達(dá)RAC1基因,其細(xì)胞周期各時(shí)相比例無(wú)明顯改變。3.成功構(gòu)建鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,成瘤率100%。照射前各組裸鼠體重穩(wěn)步上升,各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;裸鼠移植瘤生長(zhǎng)迅速,其中RAC1(+)組和RAC1(-)組的瘤體生長(zhǎng)速度略快于對(duì)照組。但在第14 d進(jìn)行4 Gy照射后,各組裸鼠體重均下降,尤其是RAC1(-)組體重下降最明顯。而各組的瘤體體積均比相應(yīng)未照射組有不同程度的縮小,其中RAC1(+)和RAC1(-)組的瘤體與照射前相比急劇縮減。裸鼠處死后,照射組移植瘤體重量均比相應(yīng)不照射組減輕,其瘤重下降率RAC1(+)組最為明顯,高達(dá)68%。瘤組織的HE染色可見(jiàn),照射后RAC1(-)組角質(zhì)纖維化、核固縮明顯,RAC1(+)組細(xì)胞大面積壞死、核碎裂明顯,其他組間差異不明顯。Western blot和免疫組化結(jié)果顯示,RAC1(-)組瘤組織P67、P47和RAC1表達(dá)下調(diào),聯(lián)合照射的RAC1(-)組下調(diào)更為明顯。RAC1(+)組P67、P47和RAC1表達(dá)增高,而聯(lián)合照射的RAC1(+)組上調(diào)更為明顯。透射電鏡下可以觀察到除對(duì)照組外,各瘤組織細(xì)胞出現(xiàn)出不同程度的超微結(jié)構(gòu)改變,其中照射后RAC1(-)組線粒體腫脹、空泡樣改變明顯,線粒體內(nèi)膜和外膜模糊不清,嵴消失,部分嵴融合;而照射RAC1(+)組細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整,出現(xiàn)細(xì)胞溶解壞死,細(xì)胞膜破裂,核碎裂,細(xì)胞器損壞消失,可見(jiàn)大量細(xì)胞碎片形成。結(jié)論:1.成功構(gòu)建沉默和過(guò)表達(dá)RAC1基因慢病毒表達(dá)載體及沉默和過(guò)表達(dá)RAC1基因的低分化鼻咽癌CNE-2細(xì)胞系。2.沉默或過(guò)表達(dá)RAC1基因能有效抑制或上調(diào)NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基P67、P47和RAC1蛋白表達(dá)。3.建立了慢病毒介導(dǎo)沉默和過(guò)表達(dá)RAC1裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),聯(lián)合4 Gy照射,過(guò)表達(dá)RAC1能明顯增加瘤體對(duì)輻射敏感性,RAC1有望成為鼻咽癌放射增敏調(diào)控新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1310377