本文關(guān)鍵詞：基于3株相互配對單克隆抗體的膠乳增強免疫比濁檢測高爾基體蛋白73方法的建立及其應(yīng)用研究

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【摘要】：目的肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是目前世界范圍內(nèi)致死率位居第五的惡性腫瘤,也是近年來發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一。HCC的進展快、預(yù)后差、惡性程度高,并且臨床上診斷為肝癌的患者已多屬于中、晚期,使之缺乏有效的治療手段,術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高,預(yù)后效果差,因此肝癌患者的早診斷、早治療尤為重要。目前,甲胎蛋白(AlphaFetoprotein,AFP)是診斷HCC最重要、最常規(guī)的血清學(xué)標志物,但其敏感性(39-64%)和特異性(76-91%)不高,使部分的早期肝癌患者無法得到及時地診斷和治療,無法滿足臨床肝癌診斷的要求。因此,尋找一種更為理想的肝癌診斷血清學(xué)標志物顯得非常重要。近年來,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)高爾基體蛋白73(Golgi Protein 73,GP73)在診斷肝癌中的敏感性和特異性均高于AFP,因此,GP73可能成為肝癌早期診斷更為理想的血清學(xué)標志物。為了評估其臨床應(yīng)用價值,我們建立了膠乳增強免疫比濁法(Latex Nanoparticle-Enhanced Turbidimetric Immunoassay,LTIA)用于血清中 GP73 的定量檢測。我們對膠乳粒子進行了表征,建立了基于多克隆抗體和3株可以兩兩配對單克隆抗體的LTIA,并對其臨床應(yīng)用進行初步評估。方法(1)膠乳粒子表征。我們采用透射電鏡(Transmission Electronic Microscopy,TEM)檢測了其粒徑大小和形態(tài);采用動態(tài)光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)檢測了其水合粒徑和Zeta電位;采用納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)檢測了其水合粒徑和納米粒子的濃度;并且采用傅里葉變換紅外分析(Ftir-850 Fourier Transform Infrared,FTIR)和電導(dǎo)滴定法測定了其羧基含量。(2)基于多克隆抗體的膠乳增強免疫比濁分析。以GP73多克隆抗體包被膠乳粒子,對膠乳粒子的粒徑、1-[3-二甲氨基丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]Carbodiimide Hydrochloride,EDC)/N-經(jīng)基琥拍酸亞胺(N-hydroxysulfosuccinimide,NHS)濃度、多抗的濃度、活化膠乳粒子的體積和聚乙二醇6000(Polyethylene Glycol,PEG-6000)濃度等實驗條件進行優(yōu)化,以GP73重組蛋白為標準品建立標準曲線,對實驗的精密度、最低檢出限、干擾進行分析,并用此方法測定80例健康人和80例肝癌患者血清中GP73含量,進行受試者工作特征曲線(Receive Operating Characteristic Curve,ROC)曲線分析。(3)基于3株單克隆抗體的膠乳增強免疫比濁分析。以3株GP73的單克隆抗體包被膠乳粒子,對EDC/NHS濃度、3株單抗的濃度、活化膠乳粒子的體積和PEG-6000濃度等實驗條件進行優(yōu)化,以GP73重組蛋白為標準品建立標準曲線,對實驗的精密度、最低檢出限、干擾進行分析,并用此方法測定80例健康人和80例肝癌患者血清中GP73含量,進行ROC曲線分析。結(jié)果(1)86 nm和107nm膠乳粒子表面光滑、分散性好;水合粒徑和濃度分析結(jié)果相差不大;Zeta電位值分別為-39.2和-41.9 mV,其絕對值均大于30 mV,說明這兩種膠乳粒子均比較穩(wěn)定;FTIR顯示粒子表面有羧基基團;電位滴定法分析其羧基含量均為0.6 mmol/g。(2)成功建立了基于多克隆的LTIA,該方法的線性范圍為20-320 ng/mL,精密度分析得到批內(nèi)變異系數(shù)(Coefficient of Variation,CV)8%,批間CV10%,最低檢出限為2.11 ng/mL,滿足其對臨床樣本的檢測要求,抗干擾能力強,ROC曲線分析得到其敏感性為94.6%,特異性為72.4%。(3)進一步建立了基于3株單克隆抗體的LTIA,線性范圍為10-350ng/mL,精密度分析得到批內(nèi)CV8%,批間CV10%,最低檢出限為1.82ng/mL,滿足其對臨床樣本的檢測要求,抗干擾能力強,ROC曲線分析得到其敏感性為96.7%,特異性為93.3%。結(jié)論本實驗成功建立了基于多克隆抗體和3株單克隆抗體的LTIA,為臨床檢測GP73提供了新的方法,并且發(fā)現(xiàn)應(yīng)用基于3株兩兩配對單克隆抗體的LTIA檢測GP73時在線性關(guān)系、檢出限、敏感性和特異性等方面均優(yōu)于基于多克隆的LTIA方法。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7;R730.43

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