本文關(guān)鍵詞：還原響應(yīng)型糖脂嫁接物膠束序貫遞釋siRNA與阿霉素的克服腫瘤耐藥研究

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【摘要】：腫瘤多藥耐藥(Multidrug resistance, MDR)是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一,外排蛋白P-糖蛋白(P-gp)的高表達是腫瘤耐藥細(xì)胞的重要特征,耐藥細(xì)胞的P-gp可將化療藥物如阿霉素等外排,導(dǎo)致化療失敗。研究表明,siRNA可沉默MDR1基因,實現(xiàn)P-gp表達的下調(diào),從而提高耐藥細(xì)胞對阿霉素的敏感性。本研究采用還原響應(yīng)型糖脂納米載體(CSO-ss-SA)序貫遞釋siRNA及DOX, siRNA下調(diào)P-gp濃度近最低點,實施序貫給藥,可得到最優(yōu)的給藥系統(tǒng)藥物療效。采用兩步酰胺反應(yīng)法,合成還原響應(yīng)型糖脂嫁接物CSO-ss-SA。核磁共振氫譜法確證嫁接物結(jié)構(gòu)。三硝基苯磺酸法測定氨基取代度8.12±1.08%。CSO-ss-SA在水中自聚集,可形成類球形且分布均勻膠束。臨界膠束濃度38.9μg/mL。膠束數(shù)均粒徑及表面電位分別為79.9±3.7nm及23.3±1.7mV。CSO-ss-SA膠束通過靜電作用密接siRNA,形成CSO-ss-SA/siRNA復(fù)合物。凝膠阻滯實驗及酶保護實驗顯示,復(fù)合物N/P=150時,CSO-ss-SA可有效密接、保護siRNA。復(fù)合物數(shù)均粒徑及表面電位分別為39.6±3.9nm及10.5±0.9mV。體外釋放研究表明,復(fù)合物在10mM和0mM谷胱甘肽(Glutathione, GSH)介質(zhì)中,12h累計釋放量分別為71.6%,28.9%,在10mM谷胱甘肽介質(zhì)中的釋放速率明顯快于在無谷胱甘肽介質(zhì)中。以堿基阿霉素為模型藥物,透析法制備嫁接物載藥納米粒(CSO-ss-SA/DOX),載藥納米粒數(shù)均粒徑65.7±2.2nm,表面電位13.9±0.8mV。當(dāng)阿霉素投藥量為10%時,載藥納米粒的包封率和載藥量分別為67.4±3.0%和6.39±0.26%。體外釋放研究表明,在GSH濃度為10mM介質(zhì)中,載藥納米粒具有快速釋藥行為,釋放速率明顯快于其在OmMGSH介質(zhì)中。以MCF-7/ADR為模型細(xì)胞。細(xì)胞攝取結(jié)果顯示,CSO-ss-SA/siRNA的內(nèi)化過程呈時間依賴性,且攝取速率較快,能有效從內(nèi)溶酶體中逃逸。實時熒光定量PCR (Real Time-PCR)測定MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)MDR1基因表達,結(jié)果顯示,MCF-7/ADR細(xì)胞與CSO-ss-SA/siRNA復(fù)合物共孵育48h,細(xì)胞內(nèi)MDR1基因表達下調(diào)至40.8%,優(yōu)于陽性對照的51.2%。CSO-ss-SA/siRNA與MCF-7/ADR細(xì)胞共孵育1～7d,P-gp表達量先逐漸下降,后逐漸恢復(fù)至正常水平,在共孵育3d時,P-gp表達量最低。共孵育1～3d,P-gp表達量逐漸下降,表明siRNA誘導(dǎo)的MDR1基因表達下降,有一個時間依賴過程。共孵育4～7d,P-gp表達量逐漸升高,表明siRNA作用后MDR1基因功能恢復(fù)。CSO-ss-SA/siRNA與MCF-7/ADR細(xì)胞共孵育不同的時間,再繼續(xù)與CSO-ss-SA/DOX共孵育4h序貫給藥,結(jié)果顯示,當(dāng)CSO-ss-SA/siRNA與MCF-7/ADR細(xì)胞共孵育3d,測得的P-gp濃度最低,MCF-7/ADR細(xì)胞對CSO-ss-SA/DOX外排最弱。選擇siRNA下調(diào)P-gp近最低點給藥,可得到最佳的藥物療效。CSO-ss-SA/siRNA與CSO-ss-SA/DOX序貫給藥,較CSO-ss-SA/DOX直接給藥藥效提高了2.3倍。胞內(nèi)ATP濃度變化結(jié)果表明,CSO-ss-SA/DOX經(jīng)內(nèi)吞途徑攝取,消耗了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ATP,抑制了P-gp的外排活性。納米給藥系統(tǒng)具有降低P-gp濃度及活性,減少DOX外排的作用,可實現(xiàn)克服腫瘤耐藥的目的。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R96;R943

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本文編號：1296433