本文關(guān)鍵詞：黃芩苷對人卵巢癌SKOV3細胞的抑制作用及其機制研究

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【摘要】：卵巢惡性腫瘤,又稱為卵巢癌,是女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一,雖然發(fā)病率次于宮頸癌和子宮體癌而位居第三,但其死亡率確占女性生殖系統(tǒng)腫瘤致死率的首位。臨床上腫瘤的治療常規(guī)以手術(shù)、放化療為主,但由于個人體質(zhì)差異使的存在,使得上述治療方法的效果也各不相同。同時由于卵巢癌起病隱匿,確診晚等情況以及惡性腫瘤普遍存在的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等問題,也加速了卵巢癌治愈率低、死亡率高等現(xiàn)狀。隨著中醫(yī)藥在治療疾病方面展現(xiàn)的獨特優(yōu)勢,其治病理念即未病先防、辨證論治、整體觀念逐漸深入人心,尤其中醫(yī)、中藥在抗腫瘤方面有著靶點多、毒副作用少的優(yōu)點,越來越受到國內(nèi)外的重視,因此,尋找安全可靠的抗腫瘤中藥復(fù)方或中藥單體成分,對未來防治腫瘤的發(fā)展具有重大意義。本論文共分為兩大部分:第一部分為文獻綜述,主要對卵巢癌的治療現(xiàn)狀、黃芩苷的主要藥理作用等方面進行概括總結(jié);第二部分為實驗研究,包括黃芩苷對人卵巢癌SKOV3細胞增殖的影響、對人卵巢癌SKOV3細胞遷移、侵襲的影響以及黃芩苷抑制人卵巢癌SKOV3細胞作用的分子機制初探。研究方法:實驗一:常規(guī)培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細胞,取對數(shù)生長的細胞均勻種于24孔板中,貼壁24h后,用不同濃度的黃芩苷分別作用于細胞,每個濃度三個復(fù)孔。加藥處理48h后,通過細胞增殖檢測試劑盒,檢測黃芩苷是否對卵巢癌細胞具有抑制作用及其最低有效抑制濃度。實驗二:常規(guī)培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細胞,取對數(shù)生長的細胞均勻種于6孔板中,分為對照和加藥兩組,每組三個平行,貼壁24h后,在6孔板內(nèi)部沿板的長邊和短邊用力均勻地劃3條平行線,人為造成"細胞傷口",兩組均加無血清培養(yǎng)基,其中加藥組加入實驗一中最低有效抑制濃度的黃芩苷,培養(yǎng)48h后,分別觀察加藥Oh、6h、12h、24h、48h時的細胞傷口愈合程度,分析黃芩苷是否能夠抑制卵巢癌細胞的遷移能力。實驗三:常規(guī)培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細胞,取對數(shù)生長的細胞用無血清培養(yǎng)基稀釋后,均勻種于已鋪滿Matrigel基質(zhì)膠的24孔Transwell小室內(nèi),在下室中加入常規(guī)培養(yǎng)基,上、下室分別加入實驗一中最低有效抑制濃度的黃芩苷,培養(yǎng)箱中孵育48h,顯微鏡下觀察細胞的侵襲程度,分析黃芩苷是否能夠抑制卵巢癌細胞的侵襲能力。實驗四:采用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western Blot,WB),通過對AKT、ERK、STAT3、NF-κB等信號通路相關(guān)蛋白以及Vimentin、Bmi1、Oct4、Sox2等腫瘤干細胞標(biāo)志物蛋白進行檢測,探討黃芩苷抑制人卵巢癌SKOV3細胞的可能分子機制。研究結(jié)果:實驗一:黃芩苷終濃度分別為0μM、2μM、5μM、10μM、20μM、40μM,與0μM比較,終濃度為2μM、5μM的黃芩苷,抑制作用不明顯,均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。終濃度為10μM、20μM、40μM的黃芩苷,有抑制作用,均有統(tǒng)計學(xué)意義,其中終濃度為10μM、20μM的黃芩苷具有顯著差異(P0.01),終濃度為40μM的黃芩苷具有極顯著差異(P0.001),因此后面的實驗,我們均采用10μM的黃芩苷進行研究。實驗二:劃痕6h時,與對照組相比,終濃度為10μM的黃芩苷具有抑制劃痕愈合的趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);劃痕12h時,與對照組相比,終濃度為10μM的黃芩苷有抑制劃痕愈合的趨勢,差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01);劃痕24h時,與對照組相比,終濃度為10μM的黃芩苷能夠明顯抑制劃痕愈合面積,有極顯著差異(p0.001);劃痕48h時,與對照組相比,終濃度為10μM的黃芩苷有抑制劃痕愈合的趨勢,有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。實驗三:與對照組相比,終濃度為10μM的黃芩苷組的細胞侵襲數(shù)量減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。實驗四:與對照組相比,在終濃度為10μM黃芩苷的作用下,人卵巢癌SKOV3細胞中 p-AKT、p-ERK、p-STAT3、p-p65、p-IκB、Vimentin、Bmi1、Oct4、Sox2 等蛋白的表達明顯減少。研究結(jié)論:1、10μM-40μM的黃芩苷能夠抑制人卵巢癌SKOV3細胞的增殖,且在該范圍內(nèi)其抑制作用具有劑量依賴性。2、10μM的黃芩苷能夠抑制人卵巢癌SKOV3細胞的遷移能力。3、10μM的黃芩苷能夠抑制人卵巢癌SKOV3細胞的侵襲能力。4、AKT、ERK、STAT3、NF-κB等通路的異常激活,可能促使人卵巢癌SKOV3細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),進而影響卵巢癌干細胞干性,使得其表面標(biāo)志物Vimentin、Bmi1、Oct4、Sox2等蛋白的表達異常升高。5、黃芩苷通過抑制p-AKT、p-ERK、p-STAT3、p-p65、p-IκB等蛋白的磷酸化,抑制AKT、ERK、STAT3、NF-κB等信號通路的激活,起到逆轉(zhuǎn)EMT過程、影響卵巢癌干細胞干性的作用。研究意義:本實驗研究結(jié)果為中藥有效成分抑制卵巢癌細胞增殖機制提供了理論與實驗依據(jù);有望為中藥在防治卵巢癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥的作用上提供實驗研究方向。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：1295779