本文關鍵詞：吳茱萸堿抗肝癌作用及機制研究

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【摘要】：吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸、石虎或疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實。數(shù)百年前已有文字記載它能夠用于治療臨床疾病,藥用價值較高。吳茱萸堿是從吳茱萸中提取的一種吲哚喹唑啉類生物堿,具有保護心臟、降血壓、減肥、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性。近年來,已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿具有抗腫瘤作用,它能夠在體外抑制胃癌、肝癌、肺癌、腸癌等癌細胞的生長。但是,目前對吳茱萸堿抗肝癌作用的研究較為淺顯、分散,對其抗肝癌作用的機制研究也較少。本課題擬對吳茱萸堿的抗肝癌作用做一個系統(tǒng)化的研究,同時對其作用機制進行初步的探討,為進一步開發(fā)應用吳茱萸堿提供一定的理論和實驗依據(jù)。目的:從整體和離體水平考察吳茱萸堿的抗肝癌作用,初步探討與其作用相關的分子機制。方法:在整體水平,小鼠和裸鼠皮下接種H22和SMMC-7721肝癌細胞,建立肝癌異位移植瘤模型。將動物隨機分為模型組、5-FU組和吳茱萸堿組。吳茱萸堿組灌胃給予吳茱萸堿20 mg/kg,體積為10 mL/kg,1次/d;5-FU組隔日腹腔注射給予氟尿嘧啶10 mg/kg,體積為10 mL/kg。給藥期間,觀察動物的一般情況,稱取體重,測量瘤體積。實驗結(jié)束后,剝?nèi)×鼋M織,稱取瘤重,進行病理組織學檢查。ELISA法檢測動物血清中AFP(Alpha fetoprotein)和 TSGF(Tumor specific growth factor)的水平。在細胞水平,采用 CCK8 法和細胞周期實驗考察吳茱萸堿對HepG2和SMMC-7721細胞增殖的影響。通過DAPI染色和流式細胞術,檢測吳茱萸堿對HepG2和SMMC-7721細胞凋亡的影響。另外,利用Transwell技術和劃痕實驗研究吳茱萸堿對HepG2和SMMC-7721細胞侵襲和遷移的作用。運用Western blot、qRT-PCR和免疫組織化學法檢測人肝癌細胞HepG2和裸鼠瘤組織中相關蛋白和mRNA水平的變化。結(jié)果;在H22肝癌小鼠異位移植瘤模型中,5-FU組小鼠進食和飲水活動減少,毛色不均,大便稀溏,其他組小鼠均未見異常。吳茱萸堿組和5-FU組瘤體積、瘤重均降低,有顯著性差異(P0.01,P0.05)。血清指標檢測結(jié)果表明,模型組小鼠血清AFP和TSGF水平較空白對照組顯著性升高(P0.01),5-FU組和吳茱萸堿組血清AFP和TSGF的水平與模型組比較顯著性降低(P0.01)。病理組織學檢查結(jié)果表明,陽性組和吳茱萸堿組瘤組織壞死程度較模型組明顯,少量瘤細胞"凋亡"。在H22肝癌裸鼠異位移植瘤模型中,給藥期間,各組裸鼠生理狀態(tài)和體重均未見異常。給予相應藥物9 d后,5-FU組和吳茱萸堿組裸鼠瘤體積明顯小于模型組(P0.01)。5-FU組和吳茱萸堿組裸鼠瘤重均低于模型組,有顯著性差異(P0.01)。血清中AFP和TSGF的水平,5-FU組和吳茱萸堿組明顯降低,與模型組比較,有顯著性差異(P0.01)。裸鼠皮下接種SMMC-7721細胞后,各組生理狀態(tài)均未見異常。體重、瘤體積和瘤重均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。病理組織學檢測發(fā)現(xiàn),吳茱萸堿組腫瘤壞死程度較模型組明顯,以凝固性壞死為主,其間可見輕微或輕度的"凋亡"樣壞死。在離體水平,吳茱萸堿能夠降低HepG2和SMMC-7721細胞的存活率,誘導細胞周期阻滯在G2/M期。DAPI染色結(jié)果顯示,吳茱萸堿組細胞體積皺縮,染色質(zhì)凝聚,10 μmol/L組中有部分細胞的細胞核裂解為碎塊,產(chǎn)生凋亡小體。HepG2和SMMC-7721細胞凋亡率分別升高至17.98%和14.64%,與對照組比較有顯著性差異(P0.01)。另外,5 μmol/L的吳茱萸堿就能使Transwell侵襲和遷移的細胞數(shù)明顯減少(P0.01)。在誘導細胞凋亡方面,吳茱萸堿能夠升高人肝癌細胞HepG2和瘤組織中cleaved-caspase3蛋白的表達水平,改變bax/bcl-2的比值,抑制p-Akt蛋白的表達。Akt激動劑SC79能夠明顯上調(diào)p-Akt和bcl-2蛋白的表達,抑制bax和cleaved-caspase3蛋白的表達。吳茱萸堿能夠明顯阻滯SC79引起的p-Akt、bcl-2、bax和cleaved-caspase3蛋白的變化。LY294002和吳茱萸堿均能減弱p-Akt蛋白的表達,與對照組比較有顯著性差異(P0.01)。在抑制侵襲、遷移方面,吳茱萸堿能夠抑制HepG2和瘤組織中β-catenin蛋白和mRNA水平的表達。吳茱萸堿組Frizzled-7和p-GSK3β蛋白的表達受到抑制,APC蛋白的水平上調(diào)。轉(zhuǎn)染Frizzled-7高表達質(zhì)粒的HepG2細胞Frizzled-7和β-catenin蛋白的表達均上升。吳茱萸堿能夠抑制Frizzled-7高表達質(zhì)粒引起的Frizzled-7和β-catenin蛋白的表達升高。結(jié)論:1.吳茱萸堿能夠抑制動物肝癌異位移植瘤的生長。2.吳茱萸堿能夠抑制肝癌細胞活性,阻滯細胞周期,誘導細胞凋亡,抑制侵襲和遷移。3.吳茱萸堿誘導肝癌細胞凋亡作用可能與抑制Akt蛋白的表達有關。4.吳茱萸堿可能通過Frizzled-7調(diào)控β-catenin的表達,影響Wnt通路,抑制肝癌細胞的侵襲和遷移。
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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本文編號：1295928