本文關(guān)鍵詞：蛋白4.1R對5-ALA轉(zhuǎn)運(yùn)及PDT抗腫瘤作用的影響與機(jī)制

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【摘要】：研究背景及目的腫瘤是威脅人類生命健康的重大復(fù)雜疾病,盡管手術(shù)、放療及化療被廣泛用作腫瘤治療的常規(guī)手段,但在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí),也會(huì)對正常組織和細(xì)胞產(chǎn)生損傷。因此尋找更為有效的綜合治療方法尤為重要。5-氨基酮戊酸介導(dǎo)的光動(dòng)力療法(5-aminolevulinic acid-based photodynamic therapy,5-ALA-PDT)目前常用于治療多種淺表腫瘤。5-ALA作為新型光敏劑,是血紅素合成的前體化合物,可被腫瘤組織特異性地吸收,經(jīng)過體內(nèi)血紅素合成的一系列代謝過程,轉(zhuǎn)變?yōu)樵策?Protoporphyrin IX,PpⅨ)。PpⅨ具有較強(qiáng)的光敏作用與熒光特性,經(jīng)過特定波長的光照射激發(fā),在組織內(nèi)分子氧的參與下產(chǎn)生強(qiáng)烈的光動(dòng)力化學(xué)反應(yīng),生成單線態(tài)氧分子及某些自由基等活性氧物質(zhì),破壞組織內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等多種生物大分子物質(zhì),促使腫瘤細(xì)胞凋亡或者壞死,從而達(dá)到治療目的。然而影響光動(dòng)力效應(yīng)的因素有多種,除了光和氧分子外,光敏劑在細(xì)胞內(nèi)高濃度的積累是重要的前提。理想的光敏劑應(yīng)能較強(qiáng)地特異積蓄于腫瘤細(xì)胞內(nèi),短時(shí)間達(dá)到高峰,且靶細(xì)胞內(nèi)的光敏劑濃度與正常組織差別越大越好。因此深入探究腫瘤細(xì)胞選擇性積累的作用機(jī)制,對于如何提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)光敏劑濃度,并提高光激發(fā)后的活性氧含量,從而增強(qiáng)PDT療效,具有重要價(jià)值。研究結(jié)果證實(shí)5-ALA通過主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞系不同其參與轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白分子也不盡相同。在神經(jīng)元等多種細(xì)胞中5-ALA通過γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GATs)進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。作為蛋白4.1家族的成員,細(xì)胞膜骨架蛋白4.1R能將跨膜蛋白與血影蛋白-肌動(dòng)蛋白復(fù)合體連接,在維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)形態(tài)、細(xì)胞分裂及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能上起到重要的作用。課題組前期研究中發(fā)現(xiàn),與野生型(4.1R~(+/+))小鼠胚胎成纖維(MEF)細(xì)胞相比,4.1R基因敲除型(4.1R~(-/-))的MEF細(xì)胞對5-ALA-PDT的敏感性降低,細(xì)胞內(nèi)積累的PpⅨ下降,而5-ALA代謝過程并沒有受到影響,提示蛋白4.1R的缺失影響了5-ALA在細(xì)胞中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而降低了5-ALA-PDT的殺傷效果。本研究以4.1R基因敲除的MEF細(xì)胞為模型,探討蛋白4.1R參與轉(zhuǎn)運(yùn)5-ALA的作用與機(jī)理,同時(shí)利用本課題組已成功構(gòu)建的野生型(4.1R~(+/+))與4.1R基因敲除型(4.1R~(-/-))小鼠肥大細(xì)胞瘤(P815)細(xì)胞系,探索在腫瘤細(xì)胞中蛋白4.1R對光動(dòng)力效應(yīng)的影響,從而為探索提高光動(dòng)力療法的方法提供理論依據(jù)。研究方法1.4.1R~(+/+)與4.1R~(-/-)MEF細(xì)胞進(jìn)行5-ALA與不同濃度的GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體GAT1、GAT2與GAT3的特異性抑制劑共同孵育,PDT處理后,CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。2.4.1R~(+/+)與4.1R~(-/-)MEF細(xì)胞同時(shí)孵育5-ALA及最佳抑制濃度的GAT1-3抑制劑,熒光分光光度計(jì)檢測兩種細(xì)胞內(nèi)PpⅨ的積累量;多功能酶標(biāo)儀檢測PDT處理后細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)含量。3.熒光定量PCR檢測4.1R~(+/+)與4.1R~(-/-)MEF細(xì)胞內(nèi)GAT1-3的基因表達(dá)量;Western blot檢測兩種細(xì)胞內(nèi)GAT1與GAT2的蛋白表達(dá)情況;細(xì)胞免疫熒光法檢測GAT1與GAT2在MEF細(xì)胞中的定位。4.免疫共沉淀技術(shù)檢測蛋白4.1R與GAT1、GAT2之間存在的相互作用。5.CCK-8法檢測4.1R~(+/+)與4.1R~(-/-)P815細(xì)胞在不同5-ALA濃度、孵育時(shí)間以及不同光照劑量條件下,PDT作用后兩種細(xì)胞的存活率情況。6.熒光分光光度計(jì)檢測4.1R~(+/+)與4.1R~(-/-)P815細(xì)胞孵育5-ALA后,細(xì)胞內(nèi)PpⅨ的積累量;多功能酶標(biāo)儀檢測5-ALA-PDT作用后兩種細(xì)胞內(nèi)的活性氧含量。7.熒光分光光度計(jì)檢測4.1R~(+/+)與4.1R~(-/-)P815細(xì)胞提前孵育能量抑制劑后,細(xì)胞內(nèi)PpⅨ的積累量。研究結(jié)果1.CCK-8法檢測細(xì)胞存活率,結(jié)果顯示加入GAT1抑制劑Tiagabine、GAT2抑制劑NNC 05-2090后,4.1R~(+/+)與4.1R~(-/-)MEF細(xì)胞的存活率均明顯增加,在Tiagabine濃度為7.5μM、NNC 05-2090濃度為2μM時(shí),抑制效果最明顯(P0.001);GAT3抑制劑(S)-SNAP-5114的加入對PDT處理后細(xì)胞的存活率基本無影響。2.熒光分光光度計(jì)及多功能酶標(biāo)儀檢測結(jié)果顯示,相比GAT1抑制劑,加入GAT2抑制劑后兩種細(xì)胞內(nèi)PpⅨ積累量與活性氧含量顯著降低(P0.001),GAT3抑制劑對PpⅨ積累量及活性氧含量基本無影響。3.熒光定量PCR結(jié)果顯示,相比4.1R~(+/+)MEF細(xì)胞,4.1R~(-/-)MEF細(xì)胞中GAT1基因表達(dá)量明顯降低(P0.01),GAT2基因的表達(dá)水平也顯著下降(P0.001),而GAT3基因的表達(dá)水平并沒有明顯變化。Western blot結(jié)果顯示,與4.1R~(+/+)MEF細(xì)胞相比,4.1R~(-/-)MEF細(xì)胞內(nèi)GAT1與GAT2蛋白表達(dá)均明顯降低。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示GAT1與GAT2定位于MEF細(xì)胞膜表面。4.免疫共沉淀結(jié)果顯示,蛋白4.1R與GAT1、GAT2之間存在相互作用。5.CCK-8法檢測結(jié)果顯示,5-ALA-PDT對4.1R~(+/+)與4.1R~(-/-)P815細(xì)胞的殺傷效果與5-ALA濃度、孵育時(shí)間以及光照劑量相關(guān),在5-ALA濃度為0.7m M,孵育3h,光照劑量為90m J/cm2時(shí),4.1R~(+/+)與4.1R~(-/-)P815細(xì)胞存活率分別為22.4%±3.1與51.1%±3.3,差異顯著(P0.001)。6.熒光分光光度計(jì)結(jié)果顯示4.1R~(+/+)與4.1R~(-/-)P815細(xì)胞內(nèi)PpⅨ積累量隨5-ALA濃度的增加而上升,在0.7m M處,4.1R~(+/+)P815細(xì)胞內(nèi)PpⅨ熒光強(qiáng)度顯著高于4.1R~(-/-)P815細(xì)胞(P0.001)。多功能酶標(biāo)儀檢測結(jié)果顯示4.1R~(+/+)P815細(xì)胞內(nèi)活性氧含量顯著高于4.1R~(-/-)P815細(xì)胞(P0.001)。7.熒光分光光度計(jì)結(jié)果顯示加入能量抑制劑后,4.1R~(+/+)與4.1R~(-/-)P815細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的PpⅨ含量顯著降低(P0.001),表明5-ALA是通過主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)入P815細(xì)胞。研究結(jié)論1.在MEF細(xì)胞中,5-ALA通過GAT1與GAT2進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),其中GAT2起主要作用。2.蛋白4.1R參與了GAT1、GAT2對5-ALA的轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而影響了5-ALA-PDT的效果。3.在腫瘤細(xì)胞P815細(xì)胞中,蛋白4.1R的缺失影響了細(xì)胞對5-ALA-PDT的敏感性,降低了PDT的效率。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5

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本文編號：1295651