本文關(guān)鍵詞：龍葵活性成分澳洲茄胺對(duì)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制

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【摘要】：研究目的:澳洲茄胺(Solasodine)是中藥龍葵的活性成分,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)由龍葵等藥物組成的中藥灌腸方具有良好的抗腸癌作用,澳洲茄胺是中藥灌腸方的有效成分之一,基于臨床實(shí)踐結(jié)果及前期實(shí)驗(yàn)探索,本課題擬研究澳洲茄胺對(duì)分化程度不同的的腸癌細(xì)胞株(HCT116、HT-29、SW480)凋亡、侵襲、遷移及相關(guān)基因表達(dá)的影響,進(jìn)一步闡明澳洲茄胺抑制腸癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制,為中醫(yī)藥治療腸癌提供新的理論依據(jù)。研究方法:1采用MTT法,觀察澳洲茄胺對(duì)人腸癌細(xì)胞HCT116、HT-29、SW480的增殖抑制作用。2采用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)研究澳洲茄胺對(duì)腸癌HCT116、HT-29、SW480細(xì)胞凋亡比例的影響。3 Hoechst 33258染色實(shí)驗(yàn),研究澳洲茄胺對(duì)腸癌HCT116、HT-29、SW480染色質(zhì)形態(tài)的影響。4 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的變化。5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化。6采用RT-qPCR法檢測(cè)澳洲茄胺對(duì)腸癌HCT116、HT-29、SW480細(xì)胞中凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及AKT/GSK3-β/β-catenin通路基因表達(dá)的影響。7采用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)澳洲茄胺對(duì)腸癌HCT116、HT-29、SW480細(xì)胞中凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及AKT/GSK3-β/β-catenin通路蛋白表達(dá)的影響。8采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)澳洲茄胺對(duì)腸癌HCT116、HT-29、SW480細(xì)胞中β-catenin胞漿聚集及核易位表達(dá)的影響。9 采用 IGF-1 主動(dòng)調(diào)控腸癌 HCT116、HT-29、SW480 細(xì)胞 AKT/GSK3-β/β-catenin通路的轉(zhuǎn)錄活性,Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AKT/GSK3-β/β-catenin通路及細(xì)胞凋亡蛋白的變化。研究結(jié)果:1 MTT實(shí)驗(yàn)提示,澳洲茄胺能有效抑制三種分化程度不同的腸癌細(xì)胞HCT116、HT-29、SW480增殖,并呈劑量、時(shí)間依賴性。2流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示澳洲茄胺能誘導(dǎo)HCT116、HT-29、SW480細(xì)胞凋亡且與濃度呈正相關(guān)。Hoechst33258熒光染色實(shí)驗(yàn)觀察到澳洲茄胺使得細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮及碎裂。3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,澳洲茄胺作用于HCT116、HT-29、SW480細(xì)胞后,Bcl-2、Bcl-xl、Survivin基因表達(dá)下降,Bax、Bak基因表達(dá)上升。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,澳洲茄胺作用于HCT116、HT-29、SW480細(xì)胞后,Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-9蛋白表達(dá)下降,Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-8、Cleaved PARP 蛋白表達(dá)上升。4 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)提示澳洲茄胺作用于HCT116、HT-29、SW480細(xì)胞后,穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少,侵襲能力減弱,并呈劑量依賴型;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出3株細(xì)胞在藥物作用下劃痕愈合速度明顯減弱,提示細(xì)胞遷移能力減弱,與藥物濃度相關(guān)。5 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,澳洲茄胺作用于HCT116、HT-29、SW480細(xì)胞后,MMP-2、MMP-9、MMP-14 基因表達(dá)減弱。Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)下調(diào),E-cadherin蛋白表達(dá)增強(qiáng)。6澳洲茄胺作用有效抑制AKT/GSK3-β/β-catenin通路的活性,RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示,AKT、β-catenin基因表達(dá)下調(diào),GSK3-β表達(dá)上調(diào);Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,澳洲茄胺能下調(diào) AKT、p-AKT、p-GSK3-β、β-catenin 及其核蛋白表達(dá),同時(shí) GSK3-β、p-β-catenin表達(dá)增強(qiáng)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示澳洲茄胺抑制了腸癌細(xì)胞中β-catenin的胞漿聚集與核轉(zhuǎn)移。7 AKT/GSK3-β/β-catenin 信號(hào)通路激動(dòng)劑 IGF-1 作用于腸癌 HCT116、HT-29、SW480細(xì)胞后,Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AKT、β-catenin、Bcl-2蛋白表達(dá)增多,GSK3-β、Bax、Cleaved PARP表達(dá)減弱,提示這條信號(hào)通路的活化抑制腸癌細(xì)胞的凋亡;而澳洲茄胺單藥及澳洲茄胺聯(lián)合IGF-1作用于3株腸癌細(xì)胞后,Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IGF-1部分逆轉(zhuǎn)了澳洲茄胺對(duì)AKT/GSK3-β/β-catenin信號(hào)通路的抑制以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的功效,提示澳洲茄胺誘導(dǎo)的腸癌細(xì)胞凋亡可能與抑制AKT/GSK3-β/β-catenin信號(hào)活性有關(guān)。研究結(jié)論:1澳洲茄胺能有效抑制人腸癌細(xì)胞HCT116、HT-29、SW480增殖并通過(guò)增加Bax/Bcl-2 比例、活化 Casβase-3、Casβase-8、Casβase-9、PARP 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。2澳洲茄胺能抑制腸癌細(xì)胞侵襲遷移,其機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2、MMP-9、MMP-14的表達(dá),上調(diào)E-cadherin的表達(dá)有關(guān)。3澳洲茄胺能抑制AKT/GSK3-β/β-catenin信號(hào)通路的激活,其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與抑制該通路的激活有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R273

【參考文獻(xiàn)】

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