本文關(guān)鍵詞：基于TGFβ3通路探討四物合劑干預(yù)順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞芳香化酶活性和表達(dá)機(jī)制的實驗研究

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【摘要】：研究目的卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指因卵巢儲備功能下降而導(dǎo)致的婦女40歲之前閉經(jīng),并伴有低雌激素和高促性腺激素的疾病。卵巢早衰的病因非常復(fù)雜,遺傳、自身免疫性疾病、醫(yī)源性損傷、放療和化療對性腺的破壞等,都可能是引起卵巢功能衰竭的原因。近幾年對卵巢早衰的治療,臨床上多用激素替代治療、卵巢移植技術(shù)、免疫療法、基因療法、心理療法等方法。但由于卵巢早衰病因比較復(fù)雜,其具體發(fā)病機(jī)制還不明確而導(dǎo)致治療效果并不盡如人意。卵巢早衰嚴(yán)重影響了患者的精神健康和生活質(zhì)量。如何減緩卵巢功能衰退的速度,改善甚至恢復(fù)卵巢的初始功能,提高患者生活質(zhì)量,滿足患者生育要求,是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中探討的熱點和難點。順鉑(cisplatin,CDDP)是一種用來治療多種腫瘤的化療藥物。有研究表明,順鉑的使用對卵巢功能有著直接的不良作用,可誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡,最終形成卵巢早衰。近年來關(guān)于癌癥化療藥物導(dǎo)致卵巢雌激素分泌水平下降,甚至形成卵巢早衰的報道日益增多。西醫(yī)對卵巢早衰多采取激素替代療法,但副作用明顯,所以中醫(yī)藥在治療卵巢早衰中越來越凸顯出其獨(dú)特的優(yōu)勢�，F(xiàn)代藥理研究表明,四物合劑即四物湯中成藥,在生物體內(nèi)參與多項重要生命活動,表現(xiàn)出抗貧血、保護(hù)心血管功能、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗衰老等多方面的藥理效應(yīng),特別是對多個靶器官表現(xiàn)出抗突變和抗藥物毒性的作用。四物合劑藥理作用靶點和途徑的揭示將為其臨床應(yīng)用提供重要的實驗依據(jù)。人類細(xì)胞色素蛋白P450芳香化酶是E2(Estradiol,雌二醇)合成的關(guān)鍵限速酶,Cyp19a1是芳香化酶的編碼基因,它在E2的分泌中起到了非常重要的作用。相關(guān)研究表明雌二醇的合成和分泌與TGFβ-Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān),而Smad2/3蛋白則是該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)分子。本研究擬通過順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細(xì)胞建立順鉑損傷型卵巢早衰模型,基于TGFβ3通路檢測四物合劑藥理血清對卵巢顆粒細(xì)胞增殖、E2分泌水平、Cyp19a1基因及其調(diào)控蛋白Smad2/3表達(dá)的影響,探究四物合劑藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞芳香化酶活性和表達(dá)的干預(yù)機(jī)制。研究方法1.MTT法觀察四物合劑藥理血清對順鉑損傷顆粒細(xì)胞增殖的影響;2.放射免疫法測定四物合劑藥理血清對順鉑損傷顆粒細(xì)胞E2分泌水平的影響,以反映四物合劑對Cyp19a1活性的影響;3.蛋白印跡法檢測四物合劑藥理血清對順鉑損傷顆粒細(xì)胞Cyp19a1及其調(diào)控蛋白Smad2/3、Psma2/3表達(dá)水平的影響;4.免疫組化法檢測四物合劑藥理血清對順鉑損傷顆粒細(xì)胞Cyp19a1及其調(diào)控蛋白Smad2/3、Psmad2/3的影響;同時加入TGFβ3分別測定四物合劑作用下Cyp19a1、Smad2/3、Psmad2/3蛋白表達(dá)水平的變化;5.加入TGFβ-Smad通路阻斷劑SB431542,通過放免法測定E2水平,免疫組化法測定Cyp19a1、Smad2/3、Psmad2/3 表達(dá)水平的變化。研究結(jié)果1.四物合劑藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響:與生理對照組相比,順鉑損傷后細(xì)胞增殖能力減弱;陽性組,四物合劑各劑量藥理血清組作用后,顆粒細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),四物合劑組中以大劑量組作用最為顯著。2.四物合劑藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞E2分泌的影響:順鉑損傷顆粒細(xì)胞后,E2分泌水平下降;模型組相比,四物合劑各劑量藥理血清組中E2分泌水平升高,以大劑量組作用最為顯著。3.四物合劑藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞Cyp19a1基因及其調(diào)控蛋白Smad2/3、Psma2/3表達(dá)的影響:蛋白印跡結(jié)果顯示,順鉑作用后,模型組Cyp19a1、Smad2/3、Psmad2/3相對表達(dá)量均較生理對照組降低;在四物合劑藥理血清組作用后,三者表達(dá)量均較模型組提升明顯,其中以四物合劑大劑量組效果較為顯著。4.加入TGFβ3后四物合劑藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞Cyp19a1及其調(diào)控蛋白Smad2/3、Psamd2/3 表達(dá)的影響:免疫組化結(jié)果顯示:順鉑可以抑制Cyp19a1、Smad2/3、Psmad2/3蛋白的表達(dá),四物合劑藥理血清作用后,三者的表達(dá)量均較模型組上升。在四物合劑藥理血清的干預(yù)過程中,加TGFβ3各藥理血清組與不加TGFβ3對應(yīng)組相比,Cyp19a1、Smad2/3、Psamd2/3表達(dá)水平均有所升高。5.加入TGFβ-Smad通路阻斷劑SB431542后四物合劑藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞E2分泌水平,Cyp19a1、Smad2/3、Psmad2/3表達(dá)水平的影響:(1)放免法結(jié)果顯示:在四物合劑藥理血清的干預(yù)過程中,加入通路阻斷劑SB431542后,E2分泌水平較無阻斷劑組顯著降低。(2)免疫組化法結(jié)果顯示:在四物合劑藥理血清的干預(yù)過程中,加阻斷劑SB431542各組與對應(yīng)不加阻斷劑各組相比,Cyp19a1、Smad2/3、Psmad2/3的表達(dá)均顯著降低。結(jié)論1.四物合劑藥理血清可以促進(jìn)順鉑損傷后顆粒細(xì)胞的增殖和分泌功能。2.四物合劑藥理血清通過上調(diào)Cyp19a1基因調(diào)控蛋白Smad2/3、Psmad2/3的表達(dá),進(jìn)而上調(diào)Cyp19a1基因的活性與表達(dá),最終實現(xiàn)其對順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞的修復(fù)作用。3.四物合劑藥理血清對順鉑損傷卵巢顆粒細(xì)胞的改善作用很可能通過TGFβ3-Smad2/3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285

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