本文關(guān)鍵詞：甲基苯丙胺誘導(dǎo)α-突觸核蛋白磷酸化致異常聚集的神經(jīng)毒性機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 甲基苯丙胺(METH) α-突觸核蛋白(α-Syn) 磷酸化α-突觸核蛋白(pS129α-Syn) 異常聚集 凋亡

【摘要】：研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)屬于苯丙胺類神經(jīng)興奮劑(Amphetamine-Typed Stimulant,ATS),其鹽酸鹽為透明的結(jié)晶體,外觀似冰,俗稱“冰毒”,在世界范圍內(nèi)被廣泛濫用。METH在給人們帶來短暫的精神和身體的快感和愉悅之余,是對(duì)健康的巨大損害。研究表明,吸食METH能產(chǎn)生很多不利的反應(yīng),包括神經(jīng)毒性,神經(jīng)心理缺陷以及心血管毒性。大量證據(jù)表明,METH主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),結(jié)構(gòu)與兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)相似,主要表現(xiàn)為多巴胺等單胺類神經(jīng)末梢的損傷,可出現(xiàn)與帕金森病(Parkinson's disease,PD)和阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)等神經(jīng)退行性疾病相似的病理改變。本實(shí)驗(yàn)室多年來致力于METH神經(jīng)毒性分子機(jī)制方面的研究,前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)在METH中毒所引起的多巴胺能系統(tǒng)損傷、氧化應(yīng)激系統(tǒng)失衡和線粒體功能障礙中發(fā)揮了重要的作用;α-Syn是由140個(gè)氨基酸組成的可溶性非折疊蛋白,是PD特征性病理結(jié)構(gòu)——路易氏小體(Lewy's body)的主要組成部分。近年來研究表明,過表達(dá)α-Syn時(shí)對(duì)神經(jīng)元有細(xì)胞毒性作用,高濃度的cα-Syn可形成β-折疊寡聚物,目前研究認(rèn)為α-Syn發(fā)生異常聚集和纖維化與PD、AD等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。METH可誘導(dǎo)神經(jīng)元出現(xiàn)與上述神經(jīng)退行性病變相類似的改變,且METH使用者患PD的比率明顯升高。前期研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)METH大鼠中毒模型中前額葉皮質(zhì)(prefrontαl cortex,pFC)、海馬(hippocαmpus,Hipp)及紋狀體(corpus striαtum)等相關(guān)腦區(qū)中α-Syn表達(dá)明顯升高。建立α-SynRNAi的METH中毒大鼠模型,當(dāng)α-Syn沉默后,動(dòng)物異常行為減少,相關(guān)指標(biāo)表明干擾α-Syn表達(dá)對(duì)氧化應(yīng)激的損傷和神經(jīng)元凋亡有保護(hù)作用。最近的研究顯示METH可以導(dǎo)致小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)產(chǎn)生類似Lewys小體的包涵體,因而抑制α-Syn異常聚集和加速其降解能否減緩神經(jīng)毒性的產(chǎn)生是目前的研究熱點(diǎn)。對(duì)PD病人的臨床病理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),無論是家族性還是散發(fā)性病例,其黑質(zhì)致密部位多巴胺能神經(jīng)元中α-Syn的絲氨酸磷酸化程度表達(dá)都很高。α-Syn的絲氨酸磷酸化主要位于129位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)α-突觸核蛋白129位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化(phosphoSer129,pS129 α-Syn)具有促進(jìn)胞漿內(nèi)蛋白聚集體形成的作用。目前對(duì)磷酸化α-Syn的正常生理功能及如何參與PD發(fā)病尚不清楚,大多數(shù)的研究認(rèn)為,磷酸化α-Syn水平增加可以引起多巴胺能神經(jīng)元的毒性損傷,但METH誘導(dǎo)的磷酸化α-Syn是否是引起異常聚集的主要原因尚不可知,因此深入研究METH誘導(dǎo)的α-Syn磷酸化致異常聚集的神經(jīng)毒性機(jī)制作用具有重要意義。目的:本研究擬通過建立METH中毒的體內(nèi)外模型,運(yùn)用分子生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等技術(shù),初步探討METH作用后α-Syn 129位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化在其寡聚體形成、神經(jīng)元損傷中的作用。通過siRNA干擾技術(shù),蛋白質(zhì)印跡、免疫熒光等檢測(cè)α-Syn、pS129 α-Syn和α-Syn的異常聚集,同時(shí)檢測(cè)凋亡maker基因(Caspase-3和PARP)蛋白表達(dá)、線粒體膜電位改變及DA等指標(biāo)的檢測(cè),從而研究METH誘導(dǎo)的α-Syn磷酸化致異常聚集的神經(jīng)毒性機(jī)制,為進(jìn)一步明確α-Syn在METH神經(jīng)毒性機(jī)制中的重要靶點(diǎn)奠定良好基礎(chǔ)。方法:1.METH誘導(dǎo)的α-Syn異常聚集和磷酸化的檢測(cè)細(xì)胞實(shí)驗(yàn),接種SH-SY5Y細(xì)胞至96孔板或6孔板中,在37℃和5%CO2條件下培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)至70%匯合時(shí),分別使用不同濃度及不同處理時(shí)間的含METH的2%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。檢測(cè)細(xì)胞METH處理后的LC25,LC50;提取細(xì)胞總蛋白,Western Blot檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡等神經(jīng)毒性進(jìn)行觀察,檢測(cè)細(xì)胞α-Syn聚集體(5G4,α-Syn異常聚集的特異性抗體),pS129 α-Syn蛋白的表達(dá)變化情況,選取適宜濃度建立細(xì)胞中毒模型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):參考文獻(xiàn)報(bào)道及本科室前期造模方法,建立METH亞急性中毒模型。Western Blot 檢測(cè)細(xì)胞 α-Syn、pS 129 α-Syn、cleaved Caspase-3 和 PARP表達(dá)情況.2.探究METH誘導(dǎo)的α-Syn磷酸化對(duì)異常聚集及其神經(jīng)毒性的影響(1)沉默PPP2R1a降低磷酸化α-Syn表達(dá):設(shè)計(jì)并合成三條siRNA干擾序列;采用RNA干擾技術(shù)(RNAi)處理SH-SY5Y細(xì)胞Western Blot法檢測(cè)pS129α-Syn檢驗(yàn)干擾效率;選擇最有效的干擾序列,采用Western Blot法和免疫熒光法檢測(cè) α-Syn、pS 129 α-Syn、cleaved caspase-3,cleaved PARP 表達(dá)變化;TUNEL法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況,JC-1試劑盒檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位變化情況。(2)BI2536降低磷酸化α-Syn表達(dá):細(xì)胞分為5組:空白對(duì)照組、對(duì)照+DMSO組、對(duì)照+BI2536組、給藥組和BI2536+給藥組,4h后,收集細(xì)胞蛋白;Western Blot 法檢測(cè) α-Syn、pS 129 α-Syn、cleaved caspase-3 和 cleaved PARP 等表達(dá)變化;免疫熒光法檢測(cè)α-Syn異常聚集變化;小鼠隨機(jī)分為4組(n=10只/組),對(duì)照組、BI2536組、給藥組和BI2536+給藥組。在METH首次給藥前24 h BI2536組和BI2536+給藥組給予單次BI2536(50mg/kg,尾靜脈注射)。Western Blot 法檢測(cè) α-Syn、pS 129 α-Syn、cleaved Caspase-3 和 PARP 等表達(dá)變化;酶化學(xué)法檢測(cè)DA的活性變化。3.初步探究METH誘導(dǎo)的磷酸化α-Syn與磷酸化Tau的相互作用及神經(jīng)毒性的研究免疫熒光檢測(cè)p-Tau、pS129 α-Syn與p-Tau共表達(dá)及使用PLK抑制劑后p-Tau的表達(dá)變化。結(jié)果:1.METH誘導(dǎo)的α-Syn磷酸化的表達(dá)變化及異常聚集的檢測(cè)(1)0-2.5 mmol/L METH處理的SH-SY5Y細(xì)胞,存活率隨METH濃度增加逐漸降低,除0.5mmol/L處理組與對(duì)照組相比無顯著性差異(p0.05)外,其他各濃度處理組與對(duì)照組比均有顯著性差異(p0.05)。(2)相比對(duì)照組,METH處理的SH-SY5Y細(xì)胞pS129 α-Syn表達(dá)隨METH濃度增加逐漸增高,選取METH濃度為2.0 mmol/L,時(shí)間為4h,建立中毒細(xì)胞模型。(3)使用特異性小鼠抗人α-Syn 5G4抗體標(biāo)識(shí)α-Syn的異常聚集,Western Blot法和免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果表明:METH給藥后α-Syn異常聚集表達(dá)顯著增多(p0.01)。(4)Westem Blot法和免疫熒光法檢測(cè)凋亡Maker基因(Caspase-3和PARP)蛋白表達(dá),相比對(duì)照組,METH給藥后表達(dá)明顯升高(p0.05)。(5)METH亞急性中毒模型組Western Blot結(jié)果表明α-Syn、pS129 α-Syn、cleaved caspase-3和PARP給藥組較對(duì)照組表達(dá)明顯升高(p0.05)。2.探究METH誘導(dǎo)的α-Syn磷酸化對(duì)異常聚集及其神經(jīng)毒性的影響2.1沉默PPP2R1 a在METH誘導(dǎo)的α-Syn磷酸化對(duì)異常聚集及其神經(jīng)毒性中的作用(1)沉默PPP2R1a表達(dá)后結(jié)果顯示均可有效抑制METH引起的pS129α-Syn表達(dá)升高。Western Blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PPP2R1a沉默后的SH-SY5Y細(xì)胞,METH引起的pS129 α-Syn的異常升高被抑制。(2)Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞α-Syn表達(dá)發(fā)現(xiàn):相比Ctrl組,METH組pS129 α-Syn 顯著升高(,p0.05),METH+siRNA#1 組細(xì)胞內(nèi) pS129 α-Syn相比于METH組顯著降低(p0.05)。在共聚焦顯微鏡觀察:METH組細(xì)胞內(nèi)α-Syn發(fā)生顯著聚集,沉默PPP2R1a可有效抑制METH誘導(dǎo)的pS129 α-Syn表達(dá),進(jìn)而抑制α-Syn的聚集的發(fā)生。(3)TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn):Ctrl+siRNA#1組細(xì)胞凋亡與Ctrl組無顯著性差異(p0.05),METH組細(xì)胞凋亡明顯上升(p0.05),METH+siRNA#1組細(xì)胞凋亡較METH組表達(dá)下降(p0.05；JC-1法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位轉(zhuǎn)換情況發(fā)現(xiàn):Ctrl+siRNA#1組細(xì)胞較Ctrl組無明顯變化(P0.05),METH組細(xì)胞線粒體膜電位降低,紅綠色熒光比值較降低Ctrl'組明顯降低(p0.05),而 METH+siRNA#1 組較 METH 組比值明顯升高(p0.05)。2.2 BI2536在METH誘導(dǎo)的α-Syn磷酸化對(duì)異常聚集及其神經(jīng)毒性中的作用(4)BI2536可顯著降低METH引起的pS129 α-Syn表達(dá)升高,當(dāng)BI2536濃度為0.4μM時(shí),抑制效果最為顯著(p0.01)。(5)Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞和各腦區(qū),結(jié)果發(fā)現(xiàn):SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)METH 組 pS129 α-Syn 的表達(dá)相比于 Ctrl 組顯著升高(p0.05),BI2536+METH組pS129 α-Syn相比于METH組顯著降低(p0.05)。免疫熒光與Western Blot結(jié)果一致;BI2536可明顯減低METH引起的α-Syn異常聚集表達(dá)(p0.05)。3.初步探究METH誘導(dǎo)的磷酸化α-Syn與磷酸化Tau的相互作用及神經(jīng)毒性的研究(1)相比于空白對(duì)照組,METH處理細(xì)胞后,p-Tau表達(dá)明顯升高。雙標(biāo)記免疫熒光檢查發(fā)現(xiàn)磷酸化α-Syn與磷酸化Tau共定位現(xiàn)象。(2)加入BI2536后,pS 129 α-Syn表達(dá)明顯降低,同時(shí)p-Tau表達(dá)也明顯降低。結(jié)論:1.在METH中毒的細(xì)胞及動(dòng)物模型中,METH誘導(dǎo)α-Syn發(fā)生異常聚集,磷酸化α-Syn表達(dá)均顯著上調(diào)并產(chǎn)生神經(jīng)毒性。2.沉默PPP2R1 a基因或使用PLK抑制劑后可有效減少磷酸化α-Syn的表達(dá),降低異常聚集的神經(jīng)毒性作用。3.使用PLK抑制劑抑制磷酸化α-Syn的研究中,也發(fā)現(xiàn)磷酸化Tau表達(dá)也明顯降低,提示磷酸化α-Syn是促進(jìn)Tau磷酸化的重要因素。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：D919.4

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張振偉;張建鵬;周婷婷;馮偉華;焦炳華;;α-突觸核蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其功能[J];生命的化學(xué);2010年01期

2 劉翠中;鄒燕;王翔;;熱休克蛋白70減輕帕金森病細(xì)胞模型中α-突觸核蛋白毒性的作用[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2010年22期

3 沈原;趙永波;劉功祿;趙圣杰;;α-突觸核蛋白的表達(dá)與氧化應(yīng)激水平的相互影響[J];中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志;2011年03期

4 夏娟;高靜;熊御云;邱晶;馬瑞;錢進(jìn)軍;;胞質(zhì)和核定位α-突觸核蛋白過表達(dá)對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的影響[J];南京大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2013年01期

5 梁源,楊慧;線粒體、α-突觸核蛋白在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用[J];中國(guó)臨床康復(fù);2005年09期

6 劉延英;楊慧;;神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究進(jìn)展:α-突觸核蛋白與線粒體[J];中國(guó)臨床康復(fù);2006年18期

7 陳濤;唐北沙;廖小平;;α-突觸核蛋白在帕金森病發(fā)病機(jī)制中的作用[J];中華神經(jīng)科雜志;2006年06期

8 劉光偉;殷娟娟;張春巖;李昕;劉耀波;李堯華;楊慧;陳彪;于順;;α-突觸核蛋白存在于大鼠腦線粒體中[J];首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年03期

9 牛丕業(yè);李慧;張意;張漫;肖揚(yáng);李變蘭;肖忠新;高艾;田琳;;錳對(duì)大鼠大腦α-突觸核蛋白表達(dá)的影響[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2009年20期

10 李文靜;姜宏;宋寧;謝俊霞;;鐵離子對(duì)α-突觸核蛋白聚集的誘發(fā)作用具有劑量和時(shí)間依賴性(英文)[J];Neuroscience Bulletin;2010年03期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 杜蕓蘭;劉振國(guó);陳生弟;李彪;陸國(guó)強(qiáng);;帕金森病小鼠模型α-突觸核蛋白表達(dá)升高并集聚[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

2 牛丕業(yè);李慧;張意;張漫;肖揚(yáng);李變蘭;肖忠新;高艾;田琳;;錳致大鼠大腦α-突觸核蛋白表達(dá)的影響[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第五次全國(guó)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2009年

3 杜蕓蘭;劉振國(guó);陳生弟;陸國(guó)強(qiáng);;百草枯誘導(dǎo)α-突觸核蛋白聚集的在體實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

4 杜蕓蘭;劉振國(guó);陳生弟;陸國(guó)強(qiáng);;百草枯誘導(dǎo)α-突觸核蛋白聚集的在體實(shí)驗(yàn)研究[A];第七屆全國(guó)老年醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨海內(nèi)外華人老年醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

5 于順;張晨;韓俊燕;溫玫;李昕;李堯華;蔡燕寧;陳彪;;α-突觸核蛋白對(duì)多巴胺神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制[A];中國(guó)神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)第六屆學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)會(huì)成立十周年慶祝大會(huì)論文摘要匯編[C];2005年

6 于順;劉光偉;殷娟娟;李昕;謝勝男;李堯華;楊慧;陳彪;;α-突觸核蛋白在腦神經(jīng)元線粒體中的定位及其對(duì)線粒體復(fù)合體Ⅰ活性的調(diào)控作用[A];第十一屆全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

7 李昕;程芙蓉;李堯華;于順;;α-突觸核蛋白對(duì)N-甲基-D-天門冬氨酸所致細(xì)胞毒性作用的影響[A];2011全國(guó)老年癡呆與衰老相關(guān)疾病學(xué)術(shù)會(huì)議第三屆山東省神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師（學(xué)術(shù)）論壇論文匯編[C];2011年

8 韓俊燕;張晨;李昕;李堯華;陳彪;于順;;α-突觸核蛋白寡聚中間體的制備以及分離與純化[A];中國(guó)神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)第六屆學(xué)術(shù)會(huì)議暨學(xué)會(huì)成立十周年慶祝大會(huì)論文摘要匯編[C];2005年

9 李昕;王鵬;李堯華;何欣;于順;;α-突觸核蛋白對(duì)大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)元突起的促生長(zhǎng)作用[A];第十一屆全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

10 王嵐;孫圣剛;曹學(xué)兵;張振濤;喬嫻;劉紅進(jìn);;格爾德霉素誘發(fā)熱休克蛋白反應(yīng)抑制α-突觸核蛋白異常聚集和細(xì)胞毒性作用[A];第九次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2006年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 本報(bào)記者 楊雪;探尋治愈頑疾之路[N];科技日?qǐng)?bào);2013年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 郜麗妍;H-Y1-2期帕金森病唇腺α-突觸核蛋白病變與腦多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體代謝對(duì)照的生物學(xué)標(biāo)記物研究[D];首都醫(yī)科大學(xué);2016年

2 胡丹;魚藤酮誘導(dǎo)α-突觸核蛋白聚集及其機(jī)制的研究[D];華中科技大學(xué);2008年

3 李文偉;α-突觸核蛋白參與MPTP誘導(dǎo)帕金森病模型的關(guān)鍵機(jī)制及蓯蓉總苷干預(yù)作用的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

4 孔濱;RNA干擾GCase對(duì)α-突觸核蛋白的影響及其機(jī)制的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

5 吳鳳霞;RNA干擾α-突觸核蛋白對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的影響及其機(jī)制[D];山東大學(xué);2009年

6 李海濤;脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)12亞型的基因特點(diǎn)、腦白質(zhì)微細(xì)結(jié)構(gòu)損害影像學(xué)特點(diǎn)、血漿α-突觸核膜蛋白表達(dá)水平的研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2014年

7 陳蕾;α-突觸核蛋白病SNCA基因A30P和A53T的突變篩查[D];天津醫(yī)科大學(xué);2009年

8 陳玲;RNA干擾α-突觸核蛋白基因表達(dá)對(duì)甲基苯丙胺神經(jīng)毒性的影響及其機(jī)制[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張瑞鋒;多系統(tǒng)萎縮患者皮膚組織中泛素和α-突觸核蛋白的表達(dá)[D];鄭州大學(xué);2015年

2 白小燕;α-突觸核蛋白基因多態(tài)性與帕金森病的相關(guān)研究[D];內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院;2014年

3 周麗敏;人工合成多肽降解α-突觸核蛋白對(duì)帕金森病的治療作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

4 張琳;α-突觸核蛋白與帕金森病的相關(guān)性[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2016年

5 王冉冉;鐵在α-突觸核蛋白磷酸化中的作用及機(jī)制研究[D];青島大學(xué);2016年

6 劉志國(guó);α-突觸核蛋白對(duì)多巴胺能細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響及其可能機(jī)制研究[D];青島大學(xué);2016年

7 劉丹丹;原發(fā)性帕金森病結(jié)腸粘膜下神經(jīng)叢α-突觸核蛋白陽(yáng)性包涵體檢測(cè)[D];鄭州大學(xué);2016年

8 盧毓璁;化合物TM對(duì)帕金森病模型中α-突觸核蛋白的降解及機(jī)制研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2017年

9 王悅;甲基苯丙胺誘導(dǎo)α-突觸核蛋白磷酸化致異常聚集的神經(jīng)毒性機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2017年

10 元紅花;不同機(jī)制細(xì)胞毒性藥物對(duì)人少突膠質(zhì)細(xì)胞系α-突觸核蛋白表達(dá)的影響[D];吉林大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：1282986