本文關(guān)鍵詞：川芎嗪對香豆酸對擬缺血模型PC12細胞損傷凋亡通路及機制研究

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【摘要】：中藥川芎為臨床上常見的中藥,它的藥效成分川芎嗪,在缺血性腦卒中醫(yī)治中應(yīng)用很普遍。為進一步提高藥物活性,本課題組在中醫(yī)理論指導(dǎo)下,利用拼合原理對川芎嗪進行結(jié)構(gòu)修飾得到了一系列新的川芎嗪化合物。其中,化合物川芎嗪對香豆酸(TMP-CA)在前期體外細胞模型篩選中表現(xiàn)出較好的神經(jīng)保護活性。前期實驗證實化合物TMP-CA能夠阻斷細胞凋亡通路中的線粒體通路,抑制細胞凋亡。(詳見張華錚畢業(yè)論文)本實驗進一步研究化合物TMP-CA對神經(jīng)生長因子(NGF)誘導(dǎo)分化后,經(jīng)氯化鈷(COCl2)擬缺血損傷大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤(PC12)細胞凋亡的影響,探索化合物TMP-CA神經(jīng)保護作用是否涉及死亡受體通路。同時,以臨床常用的神經(jīng)保護劑依達拉奉作為陽性藥,對化合物TMP-CA的藥效作初步評價。目的:以體外培養(yǎng)的NGF誘導(dǎo)分化的擬缺血損傷的PC12細胞為對象,在前期實驗基礎(chǔ)上,研究化合物TMP-CA及陽性藥依達拉奉對PC12細胞凋亡的影響,化合物TMP-CA神經(jīng)保護作用是否涉及死亡受體通路,觀察化合物TMP-CA及陽性藥依達拉奉對Bad、Bcl-xl、NF-κB/P65、Caspase-8等蛋白表達的影響,從細胞和分子水平對化合物TMP-CA對COCl2擬缺血損傷的PC12細胞的作用機理進行探討。同時,以臨床常用的神經(jīng)保護劑依達拉奉作為陽性藥,對化合物TMP-CA的藥效作初步評價。方法:1.化合物TMP-CA及陽性藥依達拉奉對PC12細胞擬缺血損傷后細胞活性的影響:NGF誘導(dǎo)分化的PC12細胞被分成正常組、模型組、TMP-CA給藥組及依達拉奉對照組。將化合物TMP-CA(30 μM)及陽性藥依達拉奉(12.5 μM、15 μM、20 μM、25μM)作用于細胞 36h 后,使用 CoCl2(280μmol/L、300μmollL)作用 12h 建立擬缺血損傷模型,MTT法測定給藥后PC12細胞活性的變化。2.化合物TMP-CA及陽性藥依達拉奉對擬缺血損傷PC12細胞凋亡的影響:采用AO/EB熒光染色及DAPI染色觀察給藥后PC12細胞凋亡的情況。3.化合物TMP-CA及陽性藥依達拉奉對擬缺血損傷的PC12細胞形態(tài)的影響及其作用機制:采用HE染色觀察細胞形態(tài)的改變。免疫細胞化學方法觀察PC12 Bad、Bcl-xl蛋白表達變化。4.化合物TMP-CA及陽性藥依達拉奉對擬缺血損傷的PC12細胞內(nèi)蛋白表達的影響:Western Blot 法檢測化合物 TMP-CA 對 PC12 細胞 NF-κ B/P65、Caspase-8 蛋白表達的影響。結(jié)果:1.MTT法檢測結(jié)果表明:化合物TMP-CA能夠提高分化后擬缺血損傷的PC12細胞活性,EC50值為13.02μM。陽性藥依達拉奉能夠提高分化后擬缺血損傷的PC12細胞活性,確定陽性藥依達拉奉最佳給藥濃度為20μM,化合物TMP-CA對PC12細胞擬缺血損傷后細胞活性的影響與陽性藥依達拉奉效果接近,依達拉奉EC50值為8.72 μ M。最佳造模濃度為300 μ mol/L。2.化合物TMP-CA(30μM)及陽性藥依達拉奉(20uM)作用于分化后擬缺血損傷的PC12細胞后:AO/EB熒光染色:與模型組相比給藥組及陽性對照組中橘紅色熒光減少,壞死及凋亡的細胞減少。DAPI染色:正常細胞核染為藍色,COCl2損傷后,細胞數(shù)量顯著減少,細胞深染,染色質(zhì)高度聚集、趨于邊緣、為團塊或新月狀。給藥組及對照組PC12數(shù)量變多,胞核狀態(tài)好轉(zhuǎn),多數(shù)呈橢圓狀。3.形態(tài)學結(jié)果觀察:①HE染色可見,分化后正常組細胞為多角形,神經(jīng)突處生長良好,模型組中細胞突起變短或消失,出現(xiàn)胞膜破裂及細胞皺縮,化合物TMP-CA組及陽性藥依達拉奉對照組中細胞維持正常形態(tài),細胞突起生長正常、密集;②模型組Bcl-xl蛋白陽性表達和正常組相比較弱,部分細胞由于胞膜的破裂,蛋白表達部位較為彌散,化合物TMP-CA給藥組和陽性藥依達拉奉對照組細胞中Bcl-xl表達有所增強;與正常組相比,模型組中Bad蛋白陽性表達增強,而化合物TMP-CA給藥組及陽性藥依達拉奉組細胞中Bad蛋白呈現(xiàn)出不同程度減弱。4.化合物TMP-CA(30 μM)及陽性藥依達拉奉(20 μM)作用于擬缺血損傷的PC12細胞后:Western blot結(jié)果表明化合物TMP-CA及陽性藥依達拉奉對NF-κ B/P65的表達影響不明顯,差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。模型組中Caspase-8的表達增強;與模型組比較化合物TMP-CA使Caspase-8的表達略有升高,但差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05);與模型組比較陽性藥依達拉奉使Caspase-8的表達略有降低,但差異不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:化合物TMP-CA在PC12細胞擬缺血損傷模型中有如下表現(xiàn):①提高細胞活性(EC50=13.02);②抑制PC12細胞凋亡;③提高Bcl-xl蛋白表達,下調(diào)Bad蛋白表達;④不影響NF-κB/P65、Caspase-8的表達�；衔颰MP-CA不是作用于死亡受體通路以減少細胞因缺血損傷引起的凋亡�；衔颰MP-CA在減少細胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護方面藥效顯著,與陽性藥依達拉奉藥效接近。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：1278111