本文關(guān)鍵詞：自噬在ATPR誘導(dǎo)的人急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞分化中的作用及其可能機(jī)制

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【摘要】：急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是造血組織的惡性疾病,約占急性髓細(xì)胞性白血病(acute myeloid leukemia,AML)的10%-15%。PML-RARα融合蛋白一直被認(rèn)為是導(dǎo)致APL發(fā)病的主要負(fù)性因素。作為一種經(jīng)典的誘導(dǎo)分化劑,全反式維甲酸(all-trans retinoic acid;ATRA)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于APL的臨床治療,并且與三氧化二砷(arsenic trioxide;As2O3)被公認(rèn)為是腫瘤靶向治療最成功的范例。它們可以直接與APL中PML-RARα融合蛋白相互作用,通過(guò)泛素化蛋白酶水解途徑或自噬依賴的途徑降解致癌蛋白,或者通過(guò)抑制m TOR激酶激活自噬從而降解PML-RARα,而自噬水平的升高可以促進(jìn)APL細(xì)胞的分化。然而,ATRA的臨床應(yīng)用仍存在維甲酸綜合征及耐藥等不足。4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯(4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR)是本課題組以ATRA為先導(dǎo)化合物設(shè)計(jì)及合成的一種新型維甲酸衍生物。前期研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)ATPR可以在體內(nèi)及體外誘導(dǎo)APL細(xì)胞的分化,但其具體作用機(jī)制仍不清楚。為了深入地研究ATPR誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化潛在的分子機(jī)制及自噬在ATPR誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化過(guò)程中的作用。本研究選用NB4細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,體外觀察ATPR對(duì)NB4細(xì)胞自噬的影響以及自噬在ATPR誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化中的作用。本文的主要研究?jī)?nèi)容包括以下三個(gè)部分:1.ATPR對(duì)NB4細(xì)胞自噬表達(dá)的影響NB4細(xì)胞經(jīng)不同梯度濃度(0、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 M;48h)的、不同時(shí)間點(diǎn)(0、24、48、72h;10-6 M)的ATPR刺激,采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3B-II、Beclin1的表達(dá)變化;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)基因ATG5、Beclin1的表達(dá)變化;單丹磺酰尸胺(MDC)染色、mcherry-EGFP-LC3B熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及透射電鏡技術(shù)觀察ATPR(10-6M)作用48h后NB4細(xì)胞中自噬小體及酸性自噬溶酶體的變化情況。結(jié)果顯示:ATPR體外用藥可誘導(dǎo)NB4細(xì)胞自噬,10-6M藥物作用48h后自噬水平升高較為顯著,自噬相關(guān)蛋白LC3B-II及Beclin1的表達(dá)量升高;ATG5及Beclin1的m RNA表達(dá)量增加;細(xì)胞中自噬小體及酸性自噬溶酶體的數(shù)量增加。2.自噬對(duì)ATPR誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的影響NB4細(xì)胞經(jīng)3-MA(5m M)預(yù)處理1h后,再給予ATPR(10-6M)作用48h,運(yùn)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3B-II、Beclin1的表達(dá)變化以及PML-RARα融合蛋白的表達(dá)情況;瑞氏吉姆薩染色檢測(cè)NB4細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)NB4細(xì)胞表面分化抗原CD11b的表達(dá)情況以及細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果顯示:3-MA作用后,ATPR誘導(dǎo)的自噬相關(guān)蛋白LC3B-II、Beclin1的表達(dá)以及PML-RARα融合蛋白的降解水平下調(diào),NB4細(xì)胞向正常細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)改變也受到抑制,阻斷自噬也降低了ATPR誘導(dǎo)的CD11b的表達(dá)以及細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期的現(xiàn)象。為了進(jìn)一步探究自噬對(duì)ATPR誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化的影響。我們應(yīng)用ATG5-siRNA預(yù)處理NB4細(xì)胞6h后,再給予ATPR(10-6M)作用48h,運(yùn)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)ATG5、LC3B-II、PML-RARα的蛋白表達(dá)情況;運(yùn)用瑞氏吉姆薩染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)NB4細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞表面分化抗原CD11b的變化情況。結(jié)果顯示:沉默ATG5可以抑制ATPR誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞LC3B-II、Beclin1的表達(dá)以及PML-RARα融合蛋白的降解水平,同時(shí)沉默ATG5也可以抑制ATPR誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞向成熟細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞表面分化抗原CD11b的表達(dá)。3.Notch1/Hes1信號(hào)通路在ATPR誘導(dǎo)NB4細(xì)胞自噬及分化中的作用NB4細(xì)胞經(jīng)ATPR(10-6M)作用48h后,運(yùn)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)Notch1和Hes1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:ATPR(10-6M)作用48h可顯著上調(diào)Notch1和Hes1的蛋白表達(dá)水平。為進(jìn)一步探究Notch1/Hes1信號(hào)通路發(fā)揮的作用,我們應(yīng)用γ-分泌酶抑制劑DAPT(10μM)預(yù)處理NB4細(xì)胞1h后,再給予ATPR(10-6M)作用48h,運(yùn)用Western Blot技術(shù)檢測(cè)Notch1、LC3B-II、PML-RARα蛋白的變化情況;運(yùn)用單丹磺酰尸胺(MDC)染色和瑞氏吉姆薩染色觀察NB4細(xì)胞中酸性自噬溶酶體的變化情況和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NB4細(xì)胞表面分化抗原CD11b的表達(dá)以及細(xì)胞周期變化情況。結(jié)果顯示:DAPT預(yù)處理后,顯著降低了ATPR誘導(dǎo)的Notch1、LC3B-II的蛋白表達(dá)及PML-RARα的降解水平,NB4細(xì)胞中酸性自噬溶酶體的數(shù)量降低,同時(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變也受到抑制,CD11b表達(dá)下調(diào),細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期受到抑制。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R733.71

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Synthesis and anti-tumor activity of all-trans retinoic acid derivatives[J];Chinese Chemical Letters;2009年07期

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本文編號(hào)：1276722