本文關(guān)鍵詞：基于微電極陣列芯片的細(xì)胞電融合方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)胞電融合技術(shù)自發(fā)明以來,由于其可控性強(qiáng)、操作簡便、對(duì)細(xì)胞無毒害等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用,逐漸成為現(xiàn)代生物工程技術(shù)中的一個(gè)重要工具,被廣泛應(yīng)用于雜交育種、單克隆抗體制備、藥物篩選等領(lǐng)域。隨著微流控技術(shù)和微加工技術(shù)的發(fā)展,細(xì)胞電融合芯片技術(shù)在最近十幾年發(fā)展尤為迅速。細(xì)胞電融合芯片技術(shù)除了具有傳統(tǒng)細(xì)胞電融合技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),還更精確高效、集成度高、便于實(shí)驗(yàn)觀察、樣本消耗少,因此在國內(nèi)外廣受關(guān)注。本論文運(yùn)用現(xiàn)代微加工技術(shù)制作了基于微電極陣列的細(xì)胞電融合芯片,利用介電電泳效應(yīng)和細(xì)胞電穿孔原理實(shí)現(xiàn)細(xì)胞排隊(duì)和電融合。細(xì)胞排隊(duì)和電穿孔是電融合中兩個(gè)最重要的過程,本論文首先對(duì)它們的機(jī)制和模型進(jìn)行了深入探討。在此基礎(chǔ)上,運(yùn)用有限元方法分析了介電電泳效應(yīng)下細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)以及電極結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞跨膜電位分布的影響,并根據(jù)仿真結(jié)果來優(yōu)化微電極陣列芯片結(jié)構(gòu),使電融合過程控制得到優(yōu)化�；诜抡娣治鲈O(shè)計(jì)了離散式電極和離散式凹槽電極結(jié)構(gòu)模型,并且對(duì)芯片加工工藝、材料、封裝技術(shù)等進(jìn)行了研究,成功研制了基于薄膜電極、離散式共面電極、離散式凹槽電極結(jié)構(gòu)的細(xì)胞電融合芯片。最后,在芯片和融合儀組成的細(xì)胞電融合平臺(tái)上進(jìn)行了多種細(xì)胞的電融合實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了新方法的有效性。具體的說,論文研究的主要工作包括以下幾點(diǎn):①細(xì)胞電融合理論分析及仿真研究在細(xì)胞介電電泳、細(xì)胞電穿孔等相關(guān)理論研究基礎(chǔ)上,利用有限元分析軟件COMSOL Multiphysics#174;對(duì)芯片內(nèi)介電電泳效應(yīng)下的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行了分析,為相應(yīng)的細(xì)胞排隊(duì)控制方法的建立與優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。同時(shí),建立了基于跨膜電位的單細(xì)胞穿孔模型,分析了電場分布態(tài)勢(shì)誘導(dǎo)的細(xì)胞跨膜電位分布情況,以及該效應(yīng)下電穿孔區(qū)域分布及電穿孔密度分析等;在此基礎(chǔ)上,基于電場聚焦效應(yīng),分析了離散式共面電極、弧性凹槽電極、矩形凹槽電極結(jié)構(gòu)參數(shù)對(duì)電場分布態(tài)勢(shì)的影響,探討了各電極結(jié)構(gòu)下細(xì)胞跨膜電位分布情況,并從中選取定型了較優(yōu)的凹槽微電極陣列,研制了對(duì)應(yīng)的微流控芯片,從而優(yōu)化了電穿孔/電融合過程控制,可以有效避免多細(xì)胞融合以及改善融合率等。②細(xì)胞電融合微流控芯片的優(yōu)化在理論分析和仿真計(jì)算基礎(chǔ)上,從芯片結(jié)構(gòu)、材料、加工工藝、封裝等方面對(duì)細(xì)胞電融合芯片進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),研制了三種芯片:基于薄膜電極、基于離散式共面電極、基于離散式凹槽電極的細(xì)胞電融合芯片。在材料選擇上主要采用低阻硅、金、鋁作為電極材料,采用聚酰亞胺多聚物、“Si O2-多晶硅-Si O2絕緣槽”+“浮地硅”結(jié)構(gòu)填充兩相鄰?fù)过X狀微電極之間的凹陷區(qū);選擇了石英玻璃、SOI等材料作為芯片基底;同時(shí)選擇了軟光刻、IC工藝等制造工藝。這一系列芯片在實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的生物相容性、抗化學(xué)腐蝕性及電氣性能等。③基于微流控芯片的細(xì)胞電融合系統(tǒng)平臺(tái)的建立根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,利用細(xì)胞電融合芯片和細(xì)胞電融合儀,搭建了基于微陣列電極芯片的細(xì)胞電融合系統(tǒng)平臺(tái)。該實(shí)驗(yàn)平臺(tái)具有操作簡便、可控性好、實(shí)驗(yàn)效果好等特點(diǎn)。通過顯微鏡和CCD構(gòu)成的圖像觀察和采集系統(tǒng),可以清晰觀察并記錄細(xì)胞電融合的全過程,并且實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)融合情況隨時(shí)調(diào)整融合參數(shù),獲得理想的排隊(duì)效率及融合效率。④微流控芯片上細(xì)胞電融合驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)研究及分析利用基于微流控芯片的細(xì)胞電融合系統(tǒng)平臺(tái)研究了多種細(xì)胞的排隊(duì)、融合實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù),包括K562細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞、成肌細(xì)胞等。新研制的芯片解決了細(xì)胞吸附在凹陷區(qū)無法融合這一問題。此外,這些新設(shè)計(jì)的微電極也使電場更加集中,降低了排隊(duì)電壓和融合電壓。通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)探索獲得了細(xì)胞排隊(duì)及融合所需的電參數(shù),并且得到了較高的細(xì)胞排隊(duì)率與細(xì)胞融合率。相對(duì)于PEG方法和傳統(tǒng)電融合法,新設(shè)計(jì)的微電極芯片的排隊(duì)及融合效率有了顯著提高,其中在薄膜電極芯片上K562細(xì)胞兩兩排隊(duì)效率為70.7%,融合率達(dá)到大約43.1%的水平;在離散式共面電極芯片上,幾乎100%的NIH3T3細(xì)胞排列在電極上,兩兩排隊(duì)效率達(dá)到69.8%,融合效率達(dá)到40%;在離散式凹槽電極芯片上,98%的NIH3T3細(xì)胞進(jìn)入凹槽,大約67.9%凹槽內(nèi)的細(xì)胞兩兩排隊(duì),融合效率達(dá)到了50.3%�？傊�,通過對(duì)細(xì)胞電融合芯片的優(yōu)化設(shè)計(jì),本論文研制出高排隊(duì)效率、高融合率的細(xì)胞電融合芯片,建立了集成融合芯片及電融合儀的細(xì)胞電融合微系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。在對(duì)多種細(xì)胞的電融合實(shí)驗(yàn)中,取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果。該研究為建立高效、自動(dòng)的細(xì)胞融合芯片系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ),有望進(jìn)一步應(yīng)用于實(shí)際研究,如雜交育種、體細(xì)胞再程序化等。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞融合 電穿孔 微流控 介電電泳 跨膜電位
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q813.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 1 引言10-26
• 1.1 研究背景及意義10-13
• 1.2 微流控芯片上細(xì)胞電融合研究現(xiàn)狀13-22
• 1.2.1 細(xì)胞排隊(duì)（配對(duì)）13-21
• 1.2.2 細(xì)胞可逆電穿孔21-22
• 1.3 現(xiàn)有方法中存在的問題22-24
• 1.4 本論文研究的內(nèi)容及目標(biāo)24-25
• 1.5 本論文工作的意義25-26
• 2 理論分析及仿真研究26-48
• 2.1 細(xì)胞排隊(duì)的機(jī)制與模型26-35
• 2.1.1 介質(zhì)的極化現(xiàn)象及受力分析26-29
• 2.1.2 介電電泳中的細(xì)胞模型29-31
• 2.1.3 細(xì)胞在DEP作用下的運(yùn)動(dòng)仿真31-35
• 2.2 細(xì)胞膜電穿孔的機(jī)制與模型35-45
• 2.2.1 細(xì)胞電穿孔理論基礎(chǔ)35-39
• 2.2.2 單細(xì)胞穿孔模型39-45
• 2.3 細(xì)胞電融合的機(jī)制與模型45
• 2.4 本章小結(jié)45-48
• 3 基于薄膜電極的細(xì)胞電融合芯片研究48-60
• 3.1 芯片的設(shè)計(jì)48-50
• 3.1.1 芯片的設(shè)計(jì)思想48-49
• 3.1.2 芯片的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)49-50
• 3.2 芯片仿真50-51
• 3.3 芯片的加工及封裝實(shí)現(xiàn)51-54
• 3.4 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的建立54-55
• 3.5 細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)研究55-58
• 3.5.1 實(shí)驗(yàn)材料55
• 3.5.2 排隊(duì)實(shí)驗(yàn)研究55-56
• 3.5.3 細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-58
• 3.6 本章小結(jié)58-60
• 4 基于離散式共面電極的細(xì)胞電融合芯片研究60-70
• 4.1 芯片的設(shè)計(jì)思想60-61
• 4.2 芯片的加工及封裝61-64
• 4.2.1 芯片的加工工藝61-63
• 4.2.2 芯片的封裝63-64
• 4.2.3 芯片測試64
• 4.3 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的建立64-65
• 4.4 細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)研究65-68
• 4.4.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象65-66
• 4.4.2 排隊(duì)實(shí)驗(yàn)研究66
• 4.4.3 細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果66-68
• 4.5 本章小結(jié)68-70
• 5 基于離散式凹槽電極的細(xì)胞電融合芯片70-94
• 5.1 芯片的設(shè)計(jì)思想70-84
• 5.1.1 基于弧形凹槽微電極陣列結(jié)構(gòu)的電場及跨膜電位仿真研究72-75
• 5.1.2 基于矩形凹槽微電極陣列結(jié)構(gòu)的電場及跨膜電位仿真研究75-84
• 5.2 芯片的加工及封裝實(shí)現(xiàn)84-87
• 5.3 實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的建立87
• 5.4 細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)研究87-91
• 5.4.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象87-88
• 5.4.2 排隊(duì)實(shí)驗(yàn)研究88-90
• 5.4.3 細(xì)胞電融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果90-91
• 5.5 本章小結(jié)91-94
• 6 總結(jié)及展望94-100
• 6.1 所取得的研究結(jié)果94-95
• 6.2 研究目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)95-96
• 6.3 創(chuàng)新點(diǎn)96
• 6.4 存在的不足與展望96-100
• 致謝100-102
• 參考文獻(xiàn)102-110
• 附錄110-111
• A. 作者在攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄110
• B. 作者在攻讀學(xué)位期間取得的科研成果目錄110-111
• C. 作者在攻讀學(xué)位期間參與的科研項(xiàng)目111

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  本文關(guān)鍵詞：基于微電極陣列芯片的細(xì)胞電融合方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：345098