本文關(guān)鍵詞：腦心肌炎病毒河南流行株病原學(xué)、診斷方法和疫苗的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腦心肌炎(EMC)是由腦心肌炎病毒(EMCV)引起的一種以腦炎、心肌炎和繁殖障礙為主要臨診特征的人畜共患傳染病。自然條件下,鼠類(lèi)是其自然貯存宿主和傳播者,感染最廣泛和受危害最嚴(yán)重的動(dòng)物是豬,人感染發(fā)病也時(shí)有發(fā)生。國(guó)內(nèi)于2005年成功分離到首株病毒,現(xiàn)已證實(shí)豬群中感染極為普遍,但抗體陽(yáng)性率差異顯著。盡管尚未發(fā)生嚴(yán)重疫情,但其威脅日趨嚴(yán)重。河南省地處中原,為養(yǎng)殖大省,加之地理環(huán)境復(fù)雜,生物多樣性豐富,嚙齒類(lèi)動(dòng)物種類(lèi)繁多、活動(dòng)頻繁,為EMCV的發(fā)生、傳播和流行提供了客觀條件,但迄今為止,關(guān)于本病在河南省的流行病學(xué)情況、病原學(xué)特征、診斷及防控技術(shù)等各項(xiàng)研究均為空白。本文通過(guò)對(duì)6株不同動(dòng)物源EMCV河南地方流行株進(jìn)行分離鑒定、全基因組測(cè)序解析、診斷方法建立、致病性試驗(yàn)、基因表達(dá)和聯(lián)合疫苗研究,以期豐富我國(guó)EMC的基礎(chǔ)理論和臨床應(yīng)用研究,將該病潛在的嚴(yán)重威脅降至最低。1.不同動(dòng)物源EMCV河南流行株的分離、鑒定及全基因組測(cè)序解析為研究EMCV對(duì)不同動(dòng)物的感染情況,本文應(yīng)用“細(xì)胞接種與RT-PCR相結(jié)合”方法,成功分離到國(guó)內(nèi)首株地方土豬源、首株家養(yǎng)野豬源、3株良種豬源和1株鼠源EMCV。由此證實(shí)EMCV已在河南省豬場(chǎng)中存在;EMCV可引起不同動(dòng)物感染,提醒在進(jìn)行地方品種養(yǎng)殖和野生動(dòng)物家養(yǎng)時(shí)要充分考慮人獸共患疫病傳播的生態(tài)學(xué)。6株分離毒的基因組序列全長(zhǎng)7 724 bp~7 735 bp不等,彼此間高度同源,與國(guó)內(nèi)豬源、鼠源分離毒處于同一分支。各基因片段中,以VP1和2A變異幅度最大,VP2和3D最為保守。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示,EMCV可分為G1、G2和G3 3個(gè)群。6株分離毒與國(guó)內(nèi)其他參考毒同屬于G1群,但分布并不完全集中,對(duì)鼠均具有高致病性。推測(cè)鼠是不同豬種之間EMCV交叉感染、傳播與流行的重要媒介。不同的EMCV地方流行株間存在較大的地域差異,其傳播具有一定的區(qū)域限制性。2.EMCV診斷方法的研究建立快速、特異和敏感的檢測(cè)方法對(duì)本病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查、病原學(xué)研究及疫苗研發(fā)等至關(guān)重要。本文以地方土豬源EMCV HNXX13的VP1基因?yàn)榘行蛄?建立了SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,特異性強(qiáng),重復(fù)性良好,靈敏度高,可為EMCV的分子流行病學(xué)調(diào)查、疫情監(jiān)測(cè)、病原學(xué)研究和快速診斷等提供技術(shù)平臺(tái)。對(duì)家養(yǎng)野豬源EMCV JZ1202的VP1基因進(jìn)行原核表達(dá)和鑒定,并以該重組蛋白作為包被抗原,建立了檢測(cè)血清抗體的間接ELISA方法。臨床初步應(yīng)用結(jié)果表明,受檢的河南省部分豬場(chǎng)陽(yáng)性場(chǎng)檢出率為65.87%,血清總陽(yáng)性率為45.30%。不同規(guī)模和不同階段豬群均存在EMCV感染,中小型豬場(chǎng)的陽(yáng)性率顯著高于規(guī)�；i場(chǎng)。EMCV與豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的混合感染率高達(dá)75.14%。本研究填補(bǔ)了河南省EMCV分子流行病學(xué)和血清流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的空白。3.PCV-2所致免疫抑制條件下繼發(fā)感染EMCV對(duì)仔豬的影響研究了PCV-2所致免疫抑制條件下繼發(fā)感染EMCV對(duì)仔豬生長(zhǎng)和致病性的影響。發(fā)現(xiàn)PCV-2先期感染可使EMCV對(duì)仔豬表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的致病性和致死性。仔豬相繼感染PCV-2和EMCV后,淋巴細(xì)胞比率及EMCV中和抗體較長(zhǎng)時(shí)間維持在低水平。研究結(jié)果表明,EMCV單獨(dú)感染組后第1 d到第9 d可從豬肛門(mén)拭子檢測(cè)、分離到病毒,而相繼感染組的排毒期則可持續(xù)至感染后第12 d,提示先感染PCV-2可延長(zhǎng)EMCV感染豬的排毒期。4.EMCV/PCV-2二聯(lián)滅活疫苗的研制和免疫效力測(cè)定國(guó)外已成功研制出EMC滅活疫苗,與其他疾病的聯(lián)合疫苗的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文研制出EMCV/PCV-2二聯(lián)滅活疫苗,接種小鼠和仔豬后發(fā)現(xiàn),免疫效果均高于相應(yīng)單苗,并可產(chǎn)生各自的高水平抗體,可完全有效抵抗EMCV和PCV-2強(qiáng)毒株的攻擊,為2種疾病的聯(lián)合免疫提供了可能,達(dá)到“一針?lè)纼刹　钡男Ч?滿足了EMCV免疫的潛在需求。5.EMCV VP1基因在桿狀病毒中的表達(dá)及其免疫原性研究應(yīng)用昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)EMCV國(guó)內(nèi)流行株VP1基因的相關(guān)研究極少。本文根據(jù)桿狀病毒密碼子的偏嗜性,對(duì)EMCV河南流行毒JZ1201的VP1基因進(jìn)行優(yōu)化和人工合成,利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得可穩(wěn)定表達(dá)VP1蛋白的重組桿狀病毒。免疫小鼠后能產(chǎn)生針對(duì)EMCV的高水平特異性中和抗體,且明顯高于EMCV全病毒滅活苗,并可明顯提高淋巴細(xì)胞的分裂、增殖能力,免疫原性良好,為進(jìn)一步研究其功能以及亞單位疫苗、診斷抗原的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。綜上所述,本文為研究我國(guó)EMCV的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)體系、致病機(jī)理、快速診斷、免疫機(jī)理以及新型疫苗研制等奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ),從而為有效防控該病提供科學(xué)理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：腦心肌炎病毒 全基因組 診斷 繼發(fā)感染 真核表達(dá) 疫苗
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 致謝4-10
• 中文摘要10-12
• Abstract12-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-25
• 1 EMCV概述15-23
• 1.1 病原學(xué)15
• 1.2 基因組特征與蛋白構(gòu)成15-17
• 1.3 流行病學(xué)17-18
• 1.4 致病性與公共衛(wèi)生意義18
• 1.5 致病機(jī)制與影響因素18-20
• 1.6 診斷方法20-22
• 1.7 疾病防控22-23
• 2 本文研究目的和意義23-25
• 第二章 不同動(dòng)物源EMCV河南流行株的分離和鑒定25-32
• 1 引言25
• 2 材料與方法25-27
• 2.1 病料采集25
• 2.2 參考毒株和細(xì)胞25
• 2.3 主要試劑和儀器25
• 2.4 病毒分離和純化25-26
• 2.5 TCID_(50)測(cè)定26
• 2.6 病毒理化特性鑒定26
• 2.7 間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定26
• 2.8 RT-PCR鑒定26-27
• 3 結(jié)果與分析27-30
• 3.1 分離物的獲得與命名27-28
• 3.2 病毒形態(tài)及理化特性鑒定28-30
• 3.3 間接免疫熒光抗體檢測(cè)分離物為EMCV陽(yáng)性30
• 3.4 RT-PCR檢測(cè)分離物為EMCV陽(yáng)性30
• 4 結(jié)論與討論30-32
• 第三章 不同動(dòng)物源EMCV河南流行株的全基因組測(cè)序和分析32-47
• 1 引言32
• 2 材料與方法32-34
• 2.1 病毒32
• 2.2 主要試劑、儀器與細(xì)胞株32
• 2.3 引物設(shè)計(jì)32-33
• 2.4 病毒總RNA提取33
• 2.5 全長(zhǎng)基因組的RT-PCR擴(kuò)增和測(cè)序33
• 2.6 同源性比較與系統(tǒng)進(jìn)化分析33-34
• 3 結(jié)果與分析34-45
• 3.1 流行株病毒的基因組序列及結(jié)構(gòu)34-35
• 3.2 不同分離株EMCV全基因組及各基因片段的同源性35-37
• 3.3 不同毒株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系37-45
• 4 結(jié)論與討論45-47
• 第四章 地方土豬源EMCV SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用47-54
• 1 引言47
• 2 材料與方法47-48
• 2.1 毒株47
• 2.2 主要試劑和儀器47
• 2.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備47-48
• 2.4 SYBR Green I real-time PCR方法建立48
• 3 結(jié)果與分析48-52
• 3.1 RT-PCR及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品48
• 3.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度48-49
• 3.3 最佳反應(yīng)條件49
• 3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線49-50
• 3.5 特異性50
• 3.6 敏感性50-51
• 3.7 可重復(fù)性51-52
• 3.8 臨床初步應(yīng)用52
• 4 結(jié)論與討論52-54
• 第五章 家養(yǎng)野豬源EMCV VP1基因的原核表達(dá)及其間接ELISA方法的建立和應(yīng)用54-66
• 1 引言54
• 2 材料與方法54-57
• 2.1 病毒、感受態(tài)細(xì)胞和表達(dá)質(zhì)粒54
• 2.2 血清54
• 2.3 主要試劑與儀器54-55
• 2.4 VP1基因的原核表達(dá)55-56
• 2.5 間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件優(yōu)化56-57
• 2.6 EMC血清流行病學(xué)調(diào)查57
• 3 結(jié)果與分析57-64
• 3.1 獲得原核表達(dá)抗原57-60
• 3.2 間接ELISA反應(yīng)條件60-63
• 3.3 EMC血清流行病學(xué)63-64
• 4 結(jié)論與討論64-66
• 第六章 PCV-2 所致免疫抑制條件下繼發(fā)感染EMCV對(duì)仔豬的影響66-76
• 1 引言66
• 2 材料與方法66-67
• 2.1 毒株和試驗(yàn)動(dòng)物66
• 2.2 主要試劑和儀器66
• 2.3 仔豬攻毒試驗(yàn)66-67
• 2.4 組織病理學(xué)檢測(cè)67
• 2.5 淋巴細(xì)胞比率測(cè)定67
• 2.6 EMCV中和抗體測(cè)定67
• 2.7 EMCV排毒情況測(cè)定67
• 3 結(jié)果與分析67-74
• 3.1 仔豬攻毒試驗(yàn)67-70
• 3.2 體溫和日增重變化70-72
• 3.3 組織病理學(xué)檢測(cè)72-73
• 3.4 淋巴細(xì)胞比率測(cè)定73-74
• 3.5 EMCV中和抗體測(cè)定74
• 3.6 EMCV排毒情況測(cè)定74
• 4 結(jié)論與討論74-76
• 第七章 EMCV/PCV-2 二聯(lián)滅活疫苗的研制和免疫效力研究76-87
• 1 引言76
• 2 材料與方法76-80
• 2.1 病毒、細(xì)胞和試驗(yàn)動(dòng)物76
• 2.2 主要試劑和儀器76
• 2.3 病毒液制備76-77
• 2.4 EMCV種毒培養(yǎng)條件研究77
• 2.5 種毒滅活和滅活效果檢驗(yàn)77
• 2.6 病毒液濃縮77
• 2.7 滅活疫苗制備77-78
• 2.8 疫苗檢驗(yàn)78
• 2.9 小鼠免疫效力檢驗(yàn)78-79
• 2.10 仔豬免疫效力檢驗(yàn)79-80
• 3 結(jié)果與分析80-86
• 3.1 EMCV種毒培養(yǎng)條件80-81
• 3.2 病毒液滅活效果檢驗(yàn)81-82
• 3.3 疫苗檢驗(yàn)82
• 3.4 小鼠免疫效力檢驗(yàn)82-85
• 3.5 仔豬免疫效力檢驗(yàn)85-86
• 4 結(jié)論與討論86-87
• 第八章 EMCV VP1基因在桿狀病毒中的表達(dá)及其免疫原性研究87-96
• 1 引言87
• 2 材料與方法87-89
• 2.1 細(xì)胞、質(zhì)粒、菌種和病毒87
• 2.2 主要試劑87
• 2.3 試驗(yàn)動(dòng)物87
• 2.4 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒p Fast Bac TM1-VP1的構(gòu)建87
• 2.5 重組穿梭載體Bacmid-VP1構(gòu)建87-88
• 2.6 重組桿狀病毒獲得88
• 2.7 SDS-PAGE鑒定88
• 2.8 蛋白純化和Western blotting分析88
• 2.9 免疫原性研究88-89
• 3 結(jié)果與分析89-95
• 3.1 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒p Fast Bac TM1-VP1構(gòu)建89-92
• 3.2 Bacmid-VP1構(gòu)建及重組桿狀病毒獲得92
• 3.3 重組蛋白SDS-PAGE鑒定、純化及Western blotting分析92-94
• 3.4 小鼠免疫試驗(yàn)94-95
• 4 結(jié)論與討論95-96
• 結(jié)論96-97
• 參考文獻(xiàn)97-108
• 作者簡(jiǎn)介及博士期間所獲科研成果及獎(jiǎng)勵(lì)108-109
• 本研究得到的項(xiàng)目資助109

【相似文獻(xiàn)】

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10 常洪濤;劉慧敏;陳陸;楊霞;趙軍;王新衛(wèi);姚惠霞;王川慶;;不同動(dòng)物源腦心肌炎病毒的分離、鑒定和全基因組序列分析[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年09期

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10 蓋新娜;楊漢春;郭鑫;陳艷紅;查振林;;豬腦心肌炎病毒分離毒株VP1和3D基因的序列分析[A];第一屆中國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)和疾病控制技術(shù)大會(huì)——2005中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2005年

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1 侯磊;腦心肌炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡的分子機(jī)制[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 馮若飛;腦心肌炎病毒雙抗原夾心ELISA建立、血清學(xué)調(diào)查、毒株分離及RNA干擾研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

3 常洪濤;腦心肌炎病毒河南流行株病原學(xué)、診斷方法和疫苗的研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 蓋新娜;豬腦心肌炎病毒VP1基因的原核表達(dá)、血清學(xué)調(diào)查及分離毒株的鑒定[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

  本文關(guān)鍵詞：腦心肌炎病毒河南流行株病原學(xué)、診斷方法和疫苗的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：345082