本文關(guān)鍵詞：昆蟲幾個(gè)蛻皮相關(guān)酶的表達(dá)和功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蛻皮是線蟲和節(jié)肢動(dòng)物等蛻皮類動(dòng)物特有的生命現(xiàn)象,是昆蟲發(fā)育變態(tài)的重要程序之一,也是昆蟲個(gè)體生長(zhǎng)所必需的生命過程。蛻皮包括真皮細(xì)胞活動(dòng)加強(qiáng)、表皮分離、蛻皮液分泌、新表皮形成、舊表皮蛻去等一系列連續(xù)的過程。在這些過程中,與其相關(guān)的酶表達(dá)也在發(fā)生著重大的變化。本研究通過對(duì)家蠶和牧草盲蝽幾種蛻皮相關(guān)酶的表達(dá)量分析,明確了蛻皮激素與蛻皮過程中的酶類尤其是酚氧化酶,多巴脫羧酶及幾丁質(zhì)酶密切相關(guān)。主要研究結(jié)果如下：(1)克隆并鑒定了家蠶酚氧化酶原基因(BmPPO)。家蠶酚氧化酶原基因由PPO1和PPO2兩種同工酶構(gòu)成。家蠶酚氧化酶原Ⅰ(BmPPOI)ORF全長(zhǎng)2058 bp,編碼685個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為79 kDa,等電點(diǎn)為6.25。家蠶酚氧化酶原ⅠI(BmPPO2)的ORF全長(zhǎng)2082bp,編碼693個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為80kDa,等電點(diǎn)為5.6。通過定量分析酚氧化酶在小蠶期和大蠶期各組織的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量,表明酚氧化酶在小蠶期的表達(dá)趨勢(shì)與家蠶蛻皮過程吻合,即蛻皮時(shí)表達(dá)量較高,而后下降。酚氧化酶在大蠶期各組織中的表達(dá)差別較大,在血淋巴和頭部表達(dá)量較高,在表皮和生殖器官中表達(dá)量較低。人工添食蛻皮激素確定血淋巴中蛻皮激素含量明顯升高的情況下,家蠶體內(nèi)酚氧化酶表達(dá)量明顯地升高,說明酚氧化酶是蛻皮過程中非常關(guān)鍵的酶類并且其表達(dá)受蛻皮激素的影響。PPo1 RNA干擾后家蠶幼蟲酚氧化酶基因表達(dá)量明顯下降,蛹期表型出現(xiàn)少數(shù)的不完全化蛹現(xiàn)象。但RNA干擾后的表型效果不明顯,可能是由于家蠶體內(nèi)酚氧化酶不是單一的一種酶,而是一組酶。當(dāng)干擾一種酚氧化酶,其干擾效果被其他的酚氧化酶彌補(bǔ)。RNA干擾后不同組織的酚氧化酶活性變化趨勢(shì)不同,頭部和血淋巴中酚氧化酶活性顯著高于對(duì)照,但在表皮中RNA干擾導(dǎo)致了酚氧化活性的下降,說明RNA干擾對(duì)不同組織的作用效果不同,可能在不同組織間具有協(xié)調(diào)作用。(2)克隆并鑒定了家蠶多巴脫羧酶(BmDdc)基因。多巴脫羧酶ORF全長(zhǎng)1437 bp,編碼478個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為54 kDa,等電點(diǎn)為5.8。通過Real-TimePCR熒光定量對(duì)多巴脫羧酶在小蠶期和大蠶期各組織的表達(dá)量分析,表明多巴脫羧酶在2齡前的表達(dá)量較低,在2齡眠蠶表達(dá)量大幅上升,而后下降；小蠶后期表現(xiàn)有規(guī)律的表達(dá)趨勢(shì),基本上是在眠蠶時(shí)期表達(dá)量高。BmDdc在大蠶期(5齡)的表皮、頭部和生殖腺的表達(dá)量變化比較大,在熟蠶和蛹前有相對(duì)較高的表達(dá)量。人工添食蛻皮激素確定血淋巴中蛻皮激素含量明顯升高的情況下,家蠶體內(nèi)多巴脫羧酶表達(dá)量與對(duì)照相比明顯升高,說明多巴脫羧酶表達(dá)受蛻皮激素的影響,是蛻皮過程中關(guān)鍵性的酶類。BmDdc RNA干擾家蠶幼蟲24hr表達(dá)量明顯的下降,蛹期表型出現(xiàn)34.4%不完全化蛹或者不化蛹表型,干擾效果明顯。用液相色譜檢測(cè)RNA干擾后不同組織的多巴脫羧酶活性,發(fā)現(xiàn)不同組織變化趨勢(shì)不大。原核表達(dá)多巴脫羧酶并制作抗體,大小符合理論值。多抗檢測(cè)其在近細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成表達(dá),而后通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外參與體表的硬化和鞣化。推測(cè)多巴脫羧酶在未蛻皮前在細(xì)胞內(nèi)大量合成,蛻皮后釋放到細(xì)胞外發(fā)揮作用。組織免疫熒光檢測(cè)表明,其主要在頭部的表面和神經(jīng)器官及表皮的真皮層表達(dá),這與其作用相一致。(3)測(cè)定了牧草盲椿的蛻皮激素滴度,其在雌雄昆蟲表現(xiàn)高度的一致性,即5齡的中后期升高,變態(tài)完成后降低,這與蛻皮激素的作用一致。我們克隆了可能與蛻皮激素相關(guān)的幾種酶的ORF,并對(duì)其進(jìn)行不同時(shí)期和組織的表達(dá)量分析。結(jié)果表明,只有牧草盲椿幾丁質(zhì)酶基因表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性和一致性,且表達(dá)規(guī)律與蛻皮過程相協(xié)調(diào)。蛻皮激素的早期誘導(dǎo)(剛孵化的5齡若蟲)明顯提高了昆蟲的死亡率,尤其是在若蟲期,同時(shí)也明顯降低了其變態(tài)率,并導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)推遲。蛻皮激素晚期誘導(dǎo)(5齡第6天,16.9℃條件下5齡持續(xù)約12天)同樣會(huì)增加昆蟲的死亡率,但是在成蟲期表現(xiàn)更為明顯,且變態(tài)效率顯著降低。同時(shí)蛻皮激素延長(zhǎng)單個(gè)昆蟲的蛻皮過程,對(duì)蛻皮的阻滯作用強(qiáng)于早期誘導(dǎo),最終導(dǎo)致20%以上的昆蟲在變態(tài)過程中死亡,這表明高濃度的蛻皮激素阻滯而非像其他昆蟲那樣促進(jìn)盲椿的變態(tài)發(fā)育。對(duì)于蛻皮機(jī)制的研究可幫助我們了解昆蟲的生命規(guī)律,同時(shí)利用其生命階段的某些特征來對(duì)相關(guān)農(nóng)業(yè)害蟲進(jìn)行防治或者對(duì)益蟲充分地利用。蛻皮激素對(duì)于蛻皮過程的綜合調(diào)控可應(yīng)用于實(shí)際的生產(chǎn)中：如家蠶5齡末期使用蛻皮激素,能使家蠶齡期縮短,促進(jìn)老熟變態(tài),吐絲營(yíng)繭速度相對(duì)加快,這可作為缺桑葉時(shí)一種提早上蔟的應(yīng)急措施,并提高上蔟整齊度。牧草盲椿蛻皮激素對(duì)其變態(tài)過程的阻滯作用可用于害蟲控制。因此闡明昆蟲蛻皮相關(guān)基因表達(dá)和調(diào)控,將為害蟲防治和益蟲生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：家蠶 牧草盲椿 蛻皮激素 酚氧化酶 多巴脫羧酶 幾丁質(zhì)酶 RNAi
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q966
【目錄】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-14
• 主要英文縮寫與譯名14-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-23
• 1.1 家蠶及盲椿簡(jiǎn)介15-17
• 1.2 蛻皮激素在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育及蛻皮過程中的作用17
• 1.3 昆蟲蛻皮過程中血液或表皮主要酶系的變化17-18
• 1.4 蛻皮相關(guān)酶的概述18-20
• 1.5 實(shí)驗(yàn)相關(guān)技術(shù)概述20-23
• 1.5.1 RNA干擾技術(shù)20-21
• 1.5.1.1 RNA干擾的作用機(jī)制20
• 1.5.1.2 RNA干擾的實(shí)現(xiàn)方法-體外酶法20-21
• 1.5.2 熒光定量PCR技術(shù)21
• 1.5.3 免疫熒光技術(shù)21-23
• 第二章 研究?jī)?nèi)容及結(jié)果23-113
• 第一節(jié) 家蠶部分23-81
• 1 家蠶蛻皮相關(guān)酶的生物信息學(xué)分析23-38
• 1.1 酚氧化酶的生物信息學(xué)分析23-29
• 1.1.1 酚氧化酶原Ⅰ(PPO1)的生物信息學(xué)分析23-26
• 1.1.2 酚氧化酶原Ⅱ(PPO2)的生物信息學(xué)分析26-29
• 1.2 幾丁質(zhì)酶(Chi)的生物信息學(xué)分析29-31
• 1.3 多巴脫羧酶(BmDdc)的生物信息學(xué)分析31-34
• 1.4 酪氨酸羥化酶(Th)的生物信息學(xué)分析34-37
• 1.5 乙酰轉(zhuǎn)移酶(At)的生物信息學(xué)分析37-38
• 2 家蠶蛻皮相關(guān)酶基因的表達(dá)量分析38-49
• 2.1 蛻皮相關(guān)酶基因小蠶期的表達(dá)量分析38-44
• 2.1.1 材料與試劑38-39
• 2.1.2 方法39-41
• 2.1.2.1 家蠶幼蟲前期全蠶總RNA的提取及第一鏈cDNA合成39-41
• 2.1.2.2 蛻皮相關(guān)酶基因在家蠶幼蟲前期的熒光定量PCR分析41
• 2.1.3 結(jié)果與討論41-44
• 2.2 蛻皮相關(guān)酶基因在大蠶期各組織的表達(dá)量分析44-49
• 2.2.1 材料與試劑44-45
• 2.2.2 方法45
• 2.2.2.1 家蠶各組織總RNA的提取及第一鏈cDNA合成45
• 2.2.2.2 蛻皮相關(guān)酶基因在大蠶期各組織的定性分析45
• 2.2.2.3 蛻皮相關(guān)酶基因在大蠶期各組織的定量分析45
• 2.2.3 結(jié)果和分析45-49
• 2.2.3.1 蛻皮相關(guān)酶基因在大蠶期各組織的定性分析45-46
• 2.2.3.2 蛻皮相關(guān)酶基因在大蠶期各組織的定量分析46-49
• 3 蛻皮激素對(duì)酶表達(dá)的影響49-55
• 3.1 材料與試劑49
• 3.2 方法49-51
• 3.2.1 家蠶各組織總RNA的提取及第一鏈cDNA合成49-50
• 3.2.2 蛻皮激素的添食50
• 3.2.3 蛻皮激素滴度的測(cè)定50-51
• 3.3 結(jié)果及分析51-55
• 3.3.1 添食蛻皮激素對(duì)家蠶蛻皮激素滴度的影響51
• 3.3.2 添食蛻皮激素對(duì)蛻皮相關(guān)基因表達(dá)量的影響51-55
• 4 家蠶蛻皮激素相關(guān)酶基因的RNAi研究55-66
• 4.1 家蠶酚氧化酶基因的RNAi研究55-61
• 4.1.1 材料與試劑55
• 4.1.2 方法55-58
• 4.1.2.1 RNA的提取和cDNA的合成55
• 4.1.2.2 dsRNA的合成55-58
• 4.1.2.3 RNAi試驗(yàn)58
• 4.1.2.4 酚氧化酶活性的測(cè)定58
• 4.1.3 結(jié)果及分析58-61
• 4.1.3.1 家蠶酚氧化酶RNAi對(duì)表型的影響58-60
• 4.1.3.2 家蠶酚氧化酶RNAi對(duì)酶活性的影響60-61
• 4.1.3.3 家蠶酚氧化酶RNAi對(duì)酶基因表達(dá)量的影響61
• 4.2 家蠶多巴脫羧酶的RNAi研究61-66
• 4.2.1 材料與試劑61
• 4.2.2 方法61-62
• 4.2.2.1 RNA的提取和cDNA的合成61-62
• 4.2.2.2 dsRNA的合成62
• 4.2.2.3 RNAi試驗(yàn)62
• 4.2.2.4 多巴脫羧酶活性測(cè)定62
• 4.2.3 結(jié)果與分析62-66
• 4.2.3.1 家蠶多巴脫羧酶RNAi對(duì)表型的影響62-64
• 4.2.3.2 家蠶多巴脫羧酶RNAi對(duì)酶活性的影響64-65
• 4.2.3.3 家蠶多巴脫羧酶RNAi對(duì)基因表達(dá)的影響65
• 4.2.3.4 細(xì)胞多巴脫羧酶RNAi對(duì)蛻皮相關(guān)基因表達(dá)量的影響65-66
• 5 家蠶多巴脫羧酶(BmDdc)的表達(dá)及定位66-81
• 5.1 材料與試劑66-69
• 5.2 方法69-74
• 5.2.1 BmDdc基因表達(dá)載體的構(gòu)建69
• 5.2.2 BmDdc基因在大腸桿菌中的表達(dá)69
• 5.2.3 Western Blot69-70
• 5.2.4 BmDdc融合表達(dá)產(chǎn)物的純化70
• 5.2.5 多克隆抗體的制備及純化70-71
• 5.2.6 多克隆抗體的組織鑒定71-73
• 5.2.6.1 家蠶BmN細(xì)胞及組織的蛋白提取71
• 5.2.6.2 BmDdc抗體的組織檢測(cè)71-73
• 5.2.7 BmDdc的細(xì)胞定位73
• 5.2.7.1 細(xì)胞的dsRNA處理73
• 5.2.7.2 細(xì)胞免疫熒光分析73
• 5.2.8 BmDdc的組織定位73-74
• 5.3 結(jié)果與討論74-81
• 5.3.1 BmDdc的原核表達(dá)74-76
• 5.3.2 BmDdc多克隆抗體的組織鑒定76
• 5.3.3 BmDdc的細(xì)胞與組織定位76-81
• 第二節(jié) 牧草盲椿部分81-113
• 1 牧草盲椿的生命發(fā)育規(guī)律81-84
• 1.1 實(shí)驗(yàn)方法82
• 1.2 牧草盲蝽生命發(fā)育過程82-84
• 2 牧草盲蝽蛻皮相關(guān)酶基因的克隆84-88
• 2.1 實(shí)驗(yàn)方法84-88
• 2.1.1 模板的合成84-85
• 2.1.2 蛻皮相關(guān)酶基因的克隆85-86
• 2.1.3 序列測(cè)序86-88
• 2.1.3.1 PCR產(chǎn)物連接86
• 2.1.3.2 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化86
• 2.1.3.3 克隆產(chǎn)物的檢測(cè)86-88
• 2.2 結(jié)果分析88
• 3 牧草盲椿蛻皮相關(guān)酶基因的表達(dá)譜88-99
• 3.1 半定量分析88-93
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)方法88-90
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果90-93
• 3.1.2.1 組織表達(dá)量分析90-91
• 3.1.2.2 發(fā)育時(shí)期表達(dá)量分析91
• 3.1.2.3 組織時(shí)期表達(dá)分析91-93
• 3.2 定量分析93-99
• 3.2.1 試驗(yàn)方法93-95
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果95-99
• 4 幾丁質(zhì)酶基因的生物信息學(xué)分析99-104
• 5 牧草盲椿蛻皮激素濃度的測(cè)定104-108
• 5.1 試驗(yàn)方法104-106
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品的收集104
• 5.1.2 蛻皮激素濃度的測(cè)定104-106
• 5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果106-108
• 6 牧草盲椿蛻皮激素調(diào)控108-113
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法108-109
• 6.1.1 蛻皮激素調(diào)控的早期誘導(dǎo)108
• 6.1.2 牧草盲椿蛻皮激素的晚期誘導(dǎo)108-109
• 6.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果109-113
• 6.2.1 早期誘導(dǎo)的基因表達(dá)109
• 6.2.2 早期誘導(dǎo)對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響109-110
• 6.2.3 蛻皮激素晚期誘導(dǎo)對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響110-113
• 第三章 結(jié)論及后續(xù)研究展望113-117
• 3.1 主要結(jié)論113-114
• 3.2 創(chuàng)新點(diǎn)114
• 3.3 后續(xù)研究展望114-117
• 參考文獻(xiàn)117-124
• 附錄124-127
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文124-126
• 參與課題126-127
• 致謝127

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 馬曉春;韓宏巖;許維岸;;家蠶表皮多酚氧化酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年17期

  本文關(guān)鍵詞：昆蟲幾個(gè)蛻皮相關(guān)酶的表達(dá)和功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：345233