本文關(guān)鍵詞：LeMAPKs A類基因在番茄花柄外植體脫落中的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：植物器官脫落是植物應(yīng)對外界環(huán)境(如干旱、鹽脅迫、病蟲害等)或放棄那些不再重要意義的器官的有效機制。植物體內(nèi)形成了復(fù)雜而精確的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制調(diào)控花器官的脫落。其中模式生物擬南芥的花器官脫落的途徑研究最為深入,其信號傳遞過程如下：BoP→AtIDA→AtHAESA→AtMKKK?→AtMKK4/MKK5→AtMPK3/MPK6→花器官脫落。其中MAPK級聯(lián)信號起到了整合外界環(huán)境信號和植物體內(nèi)激素信號的作用,從而在調(diào)控器官脫落方面起到重要作用。但此MAPK級聯(lián)信號系統(tǒng)在番茄(茄科作物中的模式生物)花柄脫落中的作用尚不清楚,探究其調(diào)控花器官脫落機理對于理解脫落發(fā)生機制以及制定防止脫落措施具有重要的實踐和理論意義。本研究主要結(jié)果如下：1.明確了LeMAPK家族A類基因參與番茄花器官脫落構(gòu)建了擬南芥MAPK和番茄MAPK系統(tǒng)進化發(fā)育樹。通過比較發(fā)現(xiàn)：參加擬南芥花器官脫落信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的AtMAPK3與LeMAPK 1,LeMAPK2；AtMAPK6和LeMAPK3遺傳距離最近,同屬于MAPK家族的A類。因此初步選擇LeMAPK1,LeMAPK2, LeMAPK3為研究對象,開展后續(xù)番茄花器官脫落的相關(guān)研究工作。自然條件下,在番茄花柄外植體脫落過程中LeMAPKI和LeMAPK2表達量都呈現(xiàn)上升趨勢；加鈣處理能夠降低脫落率,該條件下LeMAPKi和LeMAPK2基因表達的上升趨勢得到一定程度的抑制。LeMAPK3基因在番茄花柄外植體脫落過程中表達量沒有明顯的上調(diào)表達,只在脫落的后期有小幅變化。在鹽脅迫條件下,LeMAPK1/2基因在脫落的前期(12小時)起作用,而LeMAPK3在脫落期(24小時)作用。以上結(jié)果表明MAPK級聯(lián)途徑成員在番茄花柄外植體的脫落過程中表達模式不同,推測其在不同脫落階段各自發(fā)揮作用。2.MAPK級聯(lián)調(diào)節(jié)番茄花器官脫落與內(nèi)源激素和細胞壁降解酶有關(guān)使用MAPK激酶阻斷劑(MBA)對MAPK級聯(lián)參與番茄花器官脫落的機制進行了探討。MAPK阻斷劑的施加減緩了脫落發(fā)生速度,脫落速度顯著小于對照組。進一步研究發(fā)現(xiàn),阻斷劑對番茄花柄脫落過程中不同部位(遠軸端,離區(qū)和近軸端)激素水平的改變造成了影響,降低了脫落酸的含量、提高生長素的含量,而對赤霉素的調(diào)控相對較為復(fù)雜,呈現(xiàn)波動變化的模式。阻斷劑對細胞壁降解酶活性產(chǎn)生了影響,花柄離區(qū)和遠軸端纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠酯酶(CMC、PG矛口PE)酶活力都被高度抑制,而對于花柄近軸端影響較小。以上研究說明MAPK對花器官脫落的影響可能是通過內(nèi)源激素含量和細胞壁降解酶活性變化進行調(diào)節(jié)。3.MAPK阻斷劑對乙烯誘導(dǎo)的花器官脫落產(chǎn)生抑制作用乙烯能夠直接誘導(dǎo)番茄花柄外植體的脫落。研究發(fā)現(xiàn),乙烯條件下使用MAPK阻斷劑共同作用,可以降低乙烯加速花柄脫落的速度,該處理條件下激素和細胞壁降解酶活性的變化均處于阻斷劑和乙烯處理之間,說明阻斷劑能夠介入乙烯信號通路,影響了乙烯對花柄脫落的促進作用。乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受到MAPK阻斷劑的影響,推測在番茄花器官脫落過程中,乙烯和MAPK兩個信號途徑可能存在交叉,具體作用機制還有待進一步研究。4.LeMAPKs A基因的遺傳轉(zhuǎn)化明確LeMAPK1正調(diào)控花柄脫落以番茄Micro-Tom作為轉(zhuǎn)基因材料,確定了最佳番茄愈傷組織和不定芽形成培養(yǎng)基條件為：MS基本培養(yǎng)基+2.0mg/L玉米素+0.5 mg/L吲哚乙酸+3%蔗糖；誘導(dǎo)不定芽生根的理想培養(yǎng)基為1/2 MS基本培養(yǎng)基+1.5%蔗糖+0.2 mg/L吲哚丁酸。同時以pBI121為表達載體,研究了轉(zhuǎn)化細胞對卡那霉素(Kan)的敏感性,確定了最佳不定芽抗性篩選濃度為100 mg/L卡那霉素。為進一步研究LeMA4PK1,2和3在番茄花柄外植體脫落中的作用。構(gòu)建了過表達載體pBI121-LeMAPK1,pBI121-LeMAPK2和pBI121-LeMAPK3,經(jīng)農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)成功轉(zhuǎn)入番茄中,獲得了LeMAPK1和LeMAPK2過表達植株,植株中LeMAPK1和LeMAPK2相對表達量有了顯著提高,分別有2.3和2.5倍的增長。LeMAPK1超表達植株表現(xiàn)出花柄脫落的表型。
【關(guān)鍵詞】：番茄 器官脫落 MAPK 乙烯
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要12-14
• Abstract14-16
• 第一章 前言16-30
• 1.1 植物器官脫落16-17
• 1.1.1 營養(yǎng)失衡導(dǎo)致發(fā)生生理脫落16
• 1.1.2 逆境導(dǎo)致植物發(fā)生器官的脅迫脫落16-17
• 1.2 植物器官脫落與激素調(diào)控17-21
• 1.2.1 生長素類激素對脫落的影響17-18
• 1.2.2 乙烯與植物器官脫落18-20
• 1.2.3 植物器官脫落與其它內(nèi)源激素調(diào)控20-21
• 1.3 影響植物離區(qū)形成的基因及脫落的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)21-23
• 1.4 植物中的MAPK級聯(lián)系統(tǒng)23-27
• 1.4.1 MAPK的分類及特點23-24
• 1.4.2 MAPK參與生物脅迫反應(yīng)24
• 1.4.3 MAPK參與非生物脅迫反應(yīng)24-25
• 1.4.4 番茄MAPK的研究進展25-26
• 1.4.5 植物MAPK與乙烯26-27
• 1.5 植物器官脫落過程中相關(guān)酶類的研究27-29
• 1.5.1 纖維素酶27-28
• 1.5.2 多聚半乳糖醛酸酶28
• 1.5.3 其它相關(guān)酶與脫落的關(guān)系28-29
• 1.6 本研究的意義及內(nèi)容29-30
• 第二章 LeMAPKs對花柄外植體脫落的響應(yīng)30-43
• 2.1 材料與方法30-35
• 2.1.1 試驗材料30-31
• 2.1.2 試驗處理31
• 2.1.3 主要試劑和藥品31
• 2.1.4 主要儀器31-32
• 2.1.5 番茄和擬南芥MAPK進化樹構(gòu)建32
• 2.1.6 番茄花柄外植體脫落率調(diào)查方法32
• 2.1.7 LeMAPKs A引物設(shè)計32
• 2.1.8 番茄花柄外植體總RNA的提取32-33
• 2.1.9 RNA純度檢測33-34
• 2.1.10 反轉(zhuǎn)錄(合成第一條cDNA鏈)34
• 2.1.11 實時定量PCR體系34-35
• 2.1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析35
• 2.2 結(jié)果與分析35-41
• 2.2.1 LeMAPKs家族基因信息收集和整理35-36
• 2.2.2 番茄和擬南芥MAPK系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建36-37
• 2.2.3 番茄花柄外植體脫落進程分析37
• 2.2.4 引物的設(shè)計37-38
• 2.2.5 番茄總RNA提取結(jié)果38
• 2.2.6 在番茄花柄外植體脫落中LeMAPK1基因相對表達量的變化38-39
• 2.2.7 在番茄花柄外植體脫落中LeMAPK2基因相對表達量的變化39-40
• 2.2.8 在番茄花柄外植體脫落中LeMAPK3基因相對表達量的變化40
• 2.2.9 鹽脅迫下番茄花柄外植體脫落中LeMAPKs A基因表達的變化40-41
• 2.3 本章小結(jié)41-43
• 第三章 LeMAPKs A參與花器官脫落作用機制43-60
• 3.1 材料與方法43-47
• 3.1.1 試驗材料43
• 3.1.2 番茄花柄外植體處理方式43-44
• 3.1.3 主要試劑和藥品44-45
• 3.1.4 主要儀器45
• 3.1.5 MAPK阻斷劑對番茄花柄外植體LeMAPKs A表達的影響45
• 3.1.6 MAPK阻斷劑對離體番茄花柄脫落的影響45-46
• 3.1.7 粗酶液的提取46
• 3.1.8 纖維素酶活力的測定(CMC)46
• 3.1.9 多聚半乳糖醛酸酶活性測定(PG)46
• 3.1.10 果膠酯酶活性測定(PE)46
• 3.1.11 植物激素的提取46
• 3.1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析46-47
• 3.2 結(jié)果與分析47-59
• 3.2.1 番茄花柄脫落率受MAPK阻斷劑的影響47
• 3.2.2 MAPK阻斷劑對LeMAPKl相對表達的抑制效果47-48
• 3.2.3 MAPK阻斷劑對LeMAPK2相對表達的抑制效果48-49
• 3.2.4 MAPK阻斷劑對LeMAPK3相對表達的抑制效果49-50
• 3.2.5 MAPK阻斷劑對花柄外植體中生長素含量的影響50-51
• 3.2.6 MAPK阻斷劑對花柄外植體中脫落酸含量的影響51-53
• 3.2.7 MAPK阻斷劑對花柄外植體中赤霉素含量的影響53-54
• 3.2.8 MAPK阻斷劑對花柄外植體中纖維素酶活力的影響54-56
• 3.2.9 MAPK阻斷劑對花柄外植體中多聚半乳糖醛酸酶活力的影響56-57
• 3.2.10 MAPK阻斷劑對花柄外植體中果膠酯酶活力的影響57-59
• 3.3 本章小結(jié)59-60
• 第四章 LeMAPKs A參與乙烯誘導(dǎo)的番茄花柄外植體的脫落60-70
• 4.1 材料與方法60-62
• 4.1.1 試驗材料60
• 4.1.2 試驗處理60-61
• 4.1.3 主要試劑和藥品61
• 4.1.4 主要儀器61
• 4.1.5 脫落率的測定61
• 4.1.6 激素水平、細胞壁降解酶活性的測定61-62
• 4.1.7 番茄花柄離區(qū)的LeMAPKs A表達的檢測62
• 4.1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析62
• 4.2 結(jié)果與分析62-68
• 4.2.1 乙烯和MAPK阻斷劑對番茄花柄外植體脫落率的影響62-63
• 4.2.2 MAPK阻斷劑對乙烯誘導(dǎo)的番茄外植體脫落中激素水平的影響63-64
• 4.2.3 乙烯和MAPK阻斷劑對番茄花柄外植體纖維素酶的影響64-65
• 4.2.4 乙烯和MAPK阻斷劑對番茄花柄外植體多聚半乳糖醛酸酶的影響65
• 4.2.5 乙烯和MAPK阻斷劑對番茄花柄外植體果膠酯酶的影響65-66
• 4.2.6 乙烯和MAPK阻斷劑對番茄花柄外植體LeMAPK1表達的影響66-67
• 4.2.7 乙烯和MAPK阻斷劑對番茄花柄外植體LeMAPK2表達的影響67
• 4.2.8 乙烯和MAPK阻斷劑對番茄花柄外植體LeMAPK3表達的影響67-68
• 4.3 本章小結(jié)68-70
• 第五章 番茄再生系統(tǒng)建立及LeMAPKs A遺傳轉(zhuǎn)化研究70-93
• 5.1 材料與方法70-81
• 5.1.1 試驗材料70
• 5.1.2 菌株和質(zhì)粒70
• 5.1.3 主要試劑和藥品70-71
• 5.1.4 主要儀器71-72
• 5.1.5 番茄再生系統(tǒng)構(gòu)建72-73
• 5.1.6 番茄卡那霉素抗性試驗73
• 5.1.7 農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備73
• 5.1.8 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化73
• 5.1.9 農(nóng)桿菌單克隆的驗證73-74
• 5.1.10 農(nóng)桿菌侵染番茄,獲得再生植株74-75
• 5.1.11 卡那霉素抗性基因PCR引物設(shè)計75
• 5.1.12 植株DNA的提取75-76
• 5.1.13 抗性基因的擴增反應(yīng)體系76
• 5.1.14 植物表達載體構(gòu)建流程76-77
• 5.1.15 LeMAPKs A全長克隆77-78
• 5.1.16 純化并回收DNA78
• 5.1.17 目的片段與pEASY-Blunt載體連接78-79
• 5.1.18 大腸桿菌transl-T1的轉(zhuǎn)化79-80
• 5.1.19 大腸桿菌質(zhì)粒提取80
• 5.1.20 質(zhì)粒DNA雙酶切80-81
• 5.1.21 重組質(zhì)粒的構(gòu)建81
• 5.2 結(jié)果與分析81-91
• 5.2.1 玉米素對Micro-Tom愈傷組織和不定芽的影響81-82
• 5.2.2 IAA濃度對Micro-Tom番茄愈傷組織產(chǎn)生和不定芽的誘導(dǎo)82-83
• 5.2.3 不同外植體部位對番茄愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的影響83-84
• 5.2.4 不同IBA濃度對不定芽生根的誘導(dǎo)84-85
• 5.2.5 番茄再生過程85-86
• 5.2.6 Kan濃度對番茄子葉不定芽再生的影響86
• 5.2.7 抗性芽的再生86
• 5.2.8 Kan抗性植株的鑒定86-87
• 5.2.9 番茄A類LeMAPKs目的片段的克隆87-88
• 5.2.10 菌落PCR驗證88-89
• 5.2.11 番茄的pBI121-LeMAPKs A農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及植株再生89
• 5.2.12 過表達LeMAPKs A植株鑒定89-90
• 5.2.13 LeMAPKs A過表達番茄表型分析90
• 5.2.14 過表達植株基因LeMAPK1和LeMAPK2相對表達量分析90-91
• 5.3 本章小結(jié)91-93
• 全文總結(jié)93-99
• 參考文獻99-108
• 附錄108-109
• 致謝109-110
• 攻讀學(xué)位論文期間發(fā)表文章110

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李明山;宋秀英;趙曉明;郭失迷;;溫光條件和激素配比對番茄葉組織培養(yǎng)的影響[J];山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);1993年04期

  本文關(guān)鍵詞：LeMAPKs A類基因在番茄花柄外植體脫落中的作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：344558